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1996年，馬伊(yi)琍與保劍峰、陳龍、高(gao)曙光、張雅(ya)琳共同出演了(le)電視(shi)劇《真空(kong)愛情記錄》，講(jiang)述了(le)一群大學畢業(ye)生為了(le)工作和愛情奮斗的故(gu)事(shi)。

1998年，馬伊琍畢(bi)業于(yu)上海戲劇學院，畢(bi)業后參演(yan)了第一(yi)部改編自陜西駐(zhu)滬作家李春(chun)平(ping)同(tong)名小說的電影《玻璃是透明的》，飾(shi)演(yan)“小丫子”。同(tong)年，其(qi)出演(yan)了第一(yi)部古裝電影《孔(kong)乙(yi)己》。

2000年，通過出演(yan)《黑洞》提升了表演(yan)事業。同年，在電視(shi)劇《前(qian)世今生(sheng)》中(zhong)飾演(yan)美貌且(qie)氣(qi)質超(chao)凡的秦婉瑩(ying)。

2001年(nian)，出演(yan)電視劇(ju)《白天睡(shui)覺的(de)女人》中的(de)李秀。同年(nian)，在(zai)(zai)電影(ying)《西施眼》中飾演(yan)施雨，該(gai)片在(zai)(zai)2002年(nian)美國夏威夷國際電影(ying)節(jie)中獲評審團大將及亞洲最佳電影(ying)。

2002年，因出演電視劇《還(huan)珠格格Ⅲ之天(tian)上人間》中的紫(zi)薇一角而(er)被(bei)大眾所熟知(zhi)。

2004年，出演(yan)了由黃(huang)磊指導的《天(tian)一(yi)生水(shui)》，在劇中(zhong)飾(shi)演(yan)一(yi)個混血姑娘(niang)明妮。

2005年，在張黎導(dao)演的(de)電視(shi)劇《錦(jin)衣衛》中出演了(le)傾國(guo)美人客印月(yue)。

2006年，參演的《喬家大院》在央視熱播，其扮演的“江雪瑛”收(shou)獲了更多的觀眾和粉絲。

2007年，因(yin)出演由趙(zhao)寶剛指導的青(qing)春勵志(zhi)電視劇《奮斗(dou)》而(er)名聲驟(zou)起(qi)，同年6月(yue)底，馬伊琍簽約了(le)內地影視巨擎橙天(tian)娛樂。

2008年，因(yin)拍攝電視劇《為誰心(xin)動》無悔剃(ti)光了(le)頭(tou)。同(tong)年，其憑(ping)借影片《江北好人》，戰勝了(le)李冰(bing)冰(bing)、范冰(bing)冰(bing)兩位候選人，成為了(le)長春電影節(jie)影后。

2009年，馬伊琍與佟大(da)為(wei)共同出演了電視劇《婚姻(yin)保(bao)衛戰》。同年，出演的首部反映豫商故(gu)事(shi)的電視劇《經(jing)緯天地》在CCTV-8播(bo)出，這也是她(ta)繼《喬家大(da)院》之后首次登陸央視，劇中(zhong)扮演尚達志(zhi)的妻(qi)子順兒。

2010年(nian)，與涂松巖合作主演都市題材電視劇(ju)(ju)《雙(shuang)城生(sheng)活》，她在劇(ju)(ju)中塑造(zao)的北京大妞郝京妮，受到(dao)了(le)網友的普遍好評(ping)。憑借該劇(ju)(ju)，馬伊琍獲(huo)得國劇(ju)(ju)盛(sheng)典(dian)2011年(nian)度最(zui)佳女演員。

2013年(nian)年(nian)初，馬(ma)伊琍與杜淳、劉莉莉、陳(chen)思(si)斯(si)等(deng)合(he)作(zuo)出演(yan)電視劇《青春(chun)期撞上更年(nian)期2》，此(ci)外，還客串了電影《不(bu)二神探》，并且徹底(di)顛(dian)覆(fu)以往的形(xing)象痛罵文章，成(cheng)為了影片一(yi)大看點。

2013年，首(shou)當(dang)制片人的馬伊(yi)琍與首(shou)次當(dang)導演的丈夫(fu)文章合作了(le)電(dian)視劇(ju)《小爸爸》。

2015年，出演(yan)了公路(lu)犯罪片《未(wei)擇之路(lu)》。11月7日(ri)，在電視劇《北上(shang)廣不相信(xin)眼淚》中飾演(yan)潘蕓，憑該劇獲(huo)得第19屆華(hua)鼎獎中國百強電視劇最佳女主角。

2016年9月，與(yu)陳建(jian)斌合作(zuo)主演(yan)都市(shi)幽默劇《中國式關系》，飾演(yan)美(mei)女建(jian)筑設(she)計師江一楠。

2017年，主演文章執導的諜(die)戰劇《剃刀(dao)邊緣》，劇中(zhong)飾演關海(hai)丹。同年參演《建軍大(da)業》，飾演向警(jing)予(yu)角色(se)。