美洲大(da)赤魷(DosidicusGigas)在(zai)(zai)食品加工過程(cheng)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)軟(ruan)骨(gu)(gu)廢棄物(wu)為(wei)原料(liao),建立(li)包括粉碎、脫(tuo)(tuo)水脫(tuo)(tuo)脂、酶(mei)解(jie)、除蛋(dan)(dan)白(bai)、醇沉、離(li)子(zi)交換、脫(tuo)(tuo)鹽等操作流程(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)CS制備(bei)(bei)(bei)(bei)方法(fa),制備(bei)(bei)(bei)(bei)得(de)(de)到新(xin)型(xing)(xing)CS。最(zui)終產(chan)(chan)品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)率(lv)達到16±2%。用(yong)(yong)(yong)商品化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)硫(liu)(liu)酸(suan)軟(ruan)骨(gu)(gu)素(su)ABC酶(mei)、硫(liu)(liu)酸(suan)皮膚素(su)酶(mei)、透(tou)明(ming)質酸(suan)酶(mei)(來自于StreptomycesHyalurolyticus)、以(yi)及實(shi)驗室自有(you)產(chan)(chan)權的(de)(de)(de)(de)(de)(de)rHCLase降解(jie)所(suo)得(de)(de)多(duo)(duo)糖(tang)(tang),根據(ju)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)底物(wu)專一性(xing)(xing)(xing)(xing),確認所(suo)制備(bei)(bei)(bei)(bei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)糖(tang)(tang)為(wei)CS；通過咔唑反應檢(jian)(jian)測樣(yang)品中新(xin)型(xing)(xing)CS含(han)(han)量(liang),BCA蛋(dan)(dan)白(bai)定量(liang)法(fa)檢(jian)(jian)測樣(yang)品中蛋(dan)(dan)白(bai)含(han)(han)量(liang)。結(jie)(jie)果(guo)(guo)提示(shi)：樣(yang)品中新(xin)型(xing)(xing)CS含(han)(han)量(liang)達到97%以(yi)上(shang),蛋(dan)(dan)白(bai)含(han)(han)量(liang)低于2%。2.新(xin)型(xing)(xing)CS多(duo)(duo)糖(tang)(tang)結(jie)(jie)構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)初步分(fen)(fen)析(xi)(xi)：參照(zhao)葡聚糖(tang)(tang)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)標(biao)準(zhun)物(wu),經(jing)凝(ning)膠(jiao)過濾HPLC分(fen)(fen)析(xi)(xi),確定所(suo)制備(bei)(bei)(bei)(bei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)NER-CS多(duo)(duo)糖(tang)(tang)平(ping)均(jun)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)約為(wei)623.2 kDa。再通過硫(liu)(liu)酸(suan)軟(ruan)骨(gu)(gu)素(su)ABC酶(mei)完全降解(jie),結(jie)(jie)合HPLC分(fen)(fen)析(xi)(xi)二糖(tang)(tang)組成,發(fa)現NER-CS主要含(han)(han)有(you)GlcAβ1-3GalNAcGlcAβ1-3GalNAc(4S)、GlcAβ1-3GalNAc(6S)、E-unit,其中E-unit含(han)(han)量(liang)最(zui)高(gao)可達44.5%,同時GlcAp1-3GalNAc、GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含(han)(han)量(liang)分(fen)(fen)別(bie)為(wei)7.1%、12.6%、35.8%,總硫(liu)(liu)酸(suan)化度為(wei)1.37。是一種(zhong)(zhong)新(xin)型(xing)(xing)高(gao)硫(liu)(liu)酸(suan)化CS。3NER-CS生(sheng)(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)初步分(fen)(fen)析(xi)(xi)：1)用(yong)(yong)(yong)Aglyco試劑(ji)盒(he)檢(jian)(jian)測NER-CS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗凝(ning)血(xue)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)果(guo)(guo)顯(xian)示(shi)：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)分(fen)(fen)別(bie)為(wei)20±2U/mg和0.9±0.2U/mg,是陽性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)照(zhao)肝(gan)(gan)素(su)抗FⅡa活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)10%左(zuo)右,抗FXa活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)4%左(zuo)右；2)利用(yong)(yong)(yong)乳(ru)腺(xian)癌4T1細胞(bao)試驗轉移模(mo)型(xing)(xing),分(fen)(fen)析(xi)(xi)NER-CS在(zai)(zai)小鼠體內(nei)抗腫瘤轉移活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)果(guo)(guo)顯(xian)示(shi)：50、100和200μgNER-CS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抑(yi)瘤率(lv)分(fen)(fen)別(bie)為(wei)54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同時陽性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)照(zhao)100μg肝(gan)(gan)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抑(yi)瘤率(lv)為(wei)74.6±1.8%；3)用(yong)(yong)(yong)親和素(su)修飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)CM5芯片固(gu)定生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)化NER-CS,分(fen)(fen)析(xi)(xi)NER-CS與五種(zhong)(zhong)生(sheng)(sheng)長因子(zi)、三種(zhong)(zhong)選擇素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相互作用(yong)(yong)(yong)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)果(guo)(guo)顯(xian)示(shi)NER-CS與生(sheng)(sheng)長因子(zi)HGF、bFGF相互作用(yong)(yong)(yong)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)較(jiao)高(gao),親和力(li)常數分(fen)(fen)別(bie)為(wei)(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4.NER-CS寡(gua)糖(tang)(tang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)制備(bei)(bei)(bei)(bei)及其抗腫瘤活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)分(fen)(fen)析(xi)(xi)。
