黃(huang)熱(re)病(bing)毒(du)屬(shu)(1qav/virus)包含80多個(ge)成員，屬(shu)于正(zheng)鏈(lian)RNA病(bing)毒(du)，其中半(ban)數以(yi)上的(de)病(bing)毒(du)能(neng)夠誘發(fa)人和動物產生疾病(bing)，患病(bing)率高而治愈(yu)率低(di)，容易留下一(yi)些嚴(yan)重(zhong)的(de)后(hou)遺癥，給人類健康帶來很大(da)威脅，如(ru)流行性(xing)乙型腦炎(yan)病(bing)毒(du)(JEV)、登革熱(re)病(bing)病(bing)毒(du)(DEN)、黃(huang)熱(re)病(bing)毒(du)(YFV)、蜱傳腦炎(yan)病(bing)毒(du)(TBEV)等。一(yi)直(zhi)以(yi)來人們對RNA病(bing)毒(du)的(de)了解都比(bi)較缺(que)乏，無論是(shi)分子水平上的(de)機理研究(jiu)，還是(shi)宏觀上疫苗的(de)研制、藥物的(de)開發(fa)，其進展都非常(chang)緩慢。
嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)是一種(zhong)基(ji)因工(gong)程重(zhong)(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在(zai)制(zhi)備技術上并(bing)不存在(zai)太大問題(ti)，但作為重(zhong)(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在(zai)安(an)全(quan)性上還有一定(ding)的(de)(de)風險，在(zai)自然條件下，有病(bing)(bing)(bing)毒(du)之間自發產生(sheng)重(zhong)(zhong)組的(de)(de)例子，可能(neng)獲得一些意想不到的(de)(de)新型病(bing)(bing)(bing)毒(du)，比母體(ti)(ti)株(zhu)毒(du)力(li)更強，對(dui)生(sheng)物(wu)體(ti)(ti)更具有威脅(xie)性。所以在(zai)制(zhi)備嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)時(shi)，要采用已(yi)知特(te)性的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)作為嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)骨(gu)架結構，特(te)別(bie)是多(duo)選用減毒(du)株(zhu)作為載體(ti)(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)目(mu)前黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)采用的(de)(de)載體(ti)(ti)主要有以下幾(ji)種(zhong)。
YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD 疫(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)(zhu)(zhu) YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD是(shi)目前預防黃(huang)(huang)熱(re)(re)病(bing)(bing)毒感染的(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)(yi)株(zhu)(zhu)(zhu)減毒活疫(yi)(yi)苗(miao)】，始用于1936年，在(zai)過(guo)(guo)去的(de)(de)(de)6O多(duo)(duo)(duo)年中(zhong)，有(you)(you)超過(guo)(guo)3億人接(jie)種(zhong)過(guo)(guo)該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)，安全有(you)(you)效。該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)免疫(yi)(yi)原性很好，單劑量接(jie)種(zhong)后10d內，近lo0%的(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)者產生(sheng)中(zhong)和抗體(ti)(ti)，免疫(yi)(yi)力持久甚至能夠維持終身。將YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)和原病(bing)(bing)毒株(zhu)(zhu)(zhu)YF—Asibi進行序列比較后發現(xian)，該(gai)病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)抗原表位(wei)多(duo)(duo)(duo)集(ji)中(zhong)在(zai)E基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，構建(jian)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒多(duo)(duo)(duo)以(yi)這(zhe)一(yi)(yi)(yi)(yi)段基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)作(zuo)為靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。這(zhe)樣構建(jian)的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒中(zhong)，由(you)YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD株(zhu)(zhu)(zhu)保留(liu)的(de)(de)(de)NS蛋白基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)只是(shi)誘發針對該(gai)蛋白的(de)(de)(de)CTLs和非中(zhong)和性抗體(ti)(ti)，而(er)不具有(you)(you)交叉保護(hu)性，所以(yi)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒作(zuo)為疫(yi)(yi)苗(miao)使(shi)用時不會引起(qi)一(yi)(yi)(yi)(yi)般(ban)重組(zu)病(bing)(bing)毒帶來的(de)(de)(de)抗載體(ti)(ti)免疫(yi)(yi)反(fan)應，即使(shi)曾(ceng)經接(jie)種(zhong)過(guo)(guo)YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)接(jie)痘者再接(jie)種(zhong)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒也是(shi)安全有(you)(you)效的(de)(de)(de)，可以(yi)作(zuo)為一(yi)(yi)(yi)(yi)個理想的(de)(de)(de)活疫(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒載體(ti)(ti)。1989年Rice等(deng)151構建(jian)了YF一(yi)(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)感染性克隆，為構建(jian)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒提供了方便，目前文(wen)獻中(zhong)報道的(de)(de)(de)有(you)(you)關(guan)黃(huang)(huang)熱(re)(re)病(bing)(bing)毒嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)株(zhu)(zhu)(zhu)多(duo)(duo)(duo)以(yi)此病(bing)(bing)毒株(zhu)(zhu)(zhu)作(zuo)為載體(ti)(ti)病(bing)(bing)毒。已經成(cheng)功構建(jian)了包(bao)括JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個血清型(xing)病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)體(ti)(ti)。
YF一17DD 疫(yi)苗株
DEN一(yi)4變(bian)異株(zhu) 登(deng)(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)分為4個(ge)(ge)血清型，這4型病(bing)(bing)毒(du)(du)結構(gou)(gou)蛋白氨基(ji)酸(suan)序列(lie)同源性(xing)高達62%-74%，并且它們之間(jian)還有(you)很好的(de)交叉免(mian)(mian)疫(yi)原性(xing)，一(yi)直以來，人們試(shi)圖構(gou)(gou)建(jian)(jian)登(deng)(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)4價疫(yi)苗，Bray等從1991年開始(shi)登(deng)(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)研究(jiu)，以DEN一(yi)4814669株(zhu)全(quan)長克隆(long)作(zuo)(zuo)為載體，構(gou)(gou)建(jian)(jian)了(le)包括DEN—l到DEN一(yi)3的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)，結果(guo)發現幾株(zhu)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)毒(du)(du)性(xing)并沒有(you)太大改變(bian)，他們認為若能(neng)(neng)夠以一(yi)個(ge)(ge)毒(du)(du)性(xing)低(di)的(de)DEN-4病(bing)(bing)毒(du)(du)作(zuo)(zuo)為載體骨架(jia)，可能(neng)(neng)會使(shi)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)下降(jiang)，由于3端(duan)(duan)和5端(duan)(duan)非編碼(ma)區在病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)復(fu)制中(zhong)可能(neng)(neng)也(ye)起到調控作(zuo)(zuo)用，他們在構(gou)(gou)建(jian)(jian)的(de)DEN一(yi)4感染性(xing)克隆(long)的(de)基(ji)礎上，刪除其3端(duan)(duan)和5端(duan)(duan)非編碼(ma)區的(de)部分序列(lie)，結果(guo)篩(shai)選到一(yi)株(zhu)減毒(du)(du)株(zhu)，其3端(duan)(duan)去掉了(le)3O個(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)，毒(du)(du)性(xing)降(jiang)低(di)但是免(mian)(mian)疫(yi)原性(xing)并沒有(you)改變(bian)。用這個(ge)(ge)減毒(du)(du)株(zhu)作(zuo)(zuo)為載體和其它3個(ge)(ge)血清型的(de)登(deng)(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)構(gou)(gou)成嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)后(hou)(hou)，果(guo)然有(you)效地降(jiang)低(di)了(le)病(bing)(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)；其后(hou)(hou)這個(ge)(ge)載體也(ye)用于構(gou)(gou)建(jian)(jian)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)屬其他成員的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)。
DEN一(yi)4變異株
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu) 該減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)也主(zhu)要(yao)是用于合(he)成登(deng)革病(bing)毒(du)(du)的(de)嵌(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)，2O世紀8O年代(dai)初期，泰國Mahidol實(shi)驗室將4種(zhong)血清型的(de)登(deng)革病(bing)毒(du)(du)經過在(zai)細(xi)胞傳(chuan)代(dai)中后獲得(de)各自(zi)的(de)減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)，其(qi)中以DEN一(yi)2PDK一(yi)53減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)(jian)毒(du)(du)效(xiao)果最好，免疫(yi)(yi)保護(hu)力最強最持(chi)久(jiu)。將該減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)野生株(zhu)(zhu)進(jin)行比較，發現核苷酸水平(ping)上的(de)變異主(zhu)要(yao)在(zai)非結構(gou)區，說明該病(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)毒(du)(du)力有關的(de)基因可(ke)能(neng)在(zai)非結構(gou)區，而黃(huang)熱(re)病(bing)毒(du)(du)屬其(qi)他成員的(de)毒(du)(du)力基因多位(wei)于E蛋白，這樣(yang)構(gou)建的(de)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)減(jian)(jian)毒(du)(du)機(ji)制(zhi)主(zhu)要(yao)由供體株(zhu)(zhu)的(de)毒(du)(du)性(xing)起主(zhu)要(yao)因素，而由DEN一(yi)2PDK-53減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)構(gou)建的(de)嵌(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)毒(du)(du)性(xing)的(de)減(jian)(jian)弱由供體和(he)受(shou)體共同(tong)決定，更有利于減(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)獲得(de)
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2減(jian)毒(du)株作為嵌合病毒(du)的(de)(de)(de)載(zai)體(ti)還有另外(wai)一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)個好處，登(deng)(deng)革病毒(du)4個血清(qing)型之(zhi)間產(chan)生(sheng)(sheng)交(jiao)叉免疫(yi)力(li)，所以(yi)異型病毒(du)的(de)(de)(de)二次感(gan)染(ran)由于(yu)抗(kang)體(ti)依賴的(de)(de)(de)增強作用可(ke)以(yi)導致登(deng)(deng)革出(chu)血熱/登(deng)(deng)革熱休(xiu)克綜合征(zheng)(DHF/DSS)的(de)(de)(de)發生(sheng)(sheng)，理想的(de)(de)(de)登(deng)(deng)革4價疫(yi)苗誘(you)導的(de)(de)(de)免疫(yi)力(li)要針(zhen)對4種血清(qing)型病毒(du)，有效而(er)且要持久(jiu)，其(qi)中任(ren)何(he)一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)種血清(qing)型抗(kang)體(ti)的(de)(de)(de)消減(jian)都有發生(sheng)(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)可(ke)能(neng)。流行病學資料表明(ming)(ming)，DEN幾(ji)個血清(qing)型感(gan)染(ran)人的(de)(de)(de)概(gai)率(lv)(lv)是不同(tong)的(de)(de)(de)，其(qi)中以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)感(gan)染(ran)概(gai)率(lv)(lv)最高(gao)，所以(yi)由其(qi)它幾(ji)種血清(qing)型病毒(du)誘(you)發的(de)(de)(de)免疫(yi)反應很易識(shi)別(bie)DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2病毒(du)，由此(ci)DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2病毒(du)誘(you)發DHF/DSS的(de)(de)(de)概(gai)率(lv)(lv)明(ming)(ming)顯(xian)大于(yu)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)4；另外(wai)DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2病毒(du)誘(you)導的(de)(de)(de)特異免疫(yi)力(li)又明(ming)(ming)顯(xian)弱于(yu)其(qi)它3型，所以(yi)制(zhi)備以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2為基礎的(de)(de)(de)4價疫(yi)苗和傳(chuan)統(tong)疫(yi)苗比較，減(jian)少了DEN—l、一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)4種血清(qing)型NS3蛋(dan)白誘(you)發的(de)(de)(de)交(jiao)叉免疫(yi)反應之(zhi)間的(de)(de)(de)干擾作用，減(jian)少了DHF/DSS的(de)(de)(de)可(ke)能(neng)，同(tong)時又能(neng)有效而(er)持久(jiu)地(di)誘(you)導機體(ti)產(chan)生(sheng)(sheng)針(zhen)對4種血清(qing)型的(de)(de)(de)免疫(yi)反應，從(cong)而(er)起到預防作用。
克隆法 嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)獲得(de)大多是利用感(gan)染性(xing)克隆技術(shu)，目前已有(you)部分(fen)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)獲得(de)了感(gan)染性(xing)克隆，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、墨(mo)累(lei)河谷腦炎病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(MVE)、西尼羅河病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(WNV)、DEN4型病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，這些克隆包(bao)含有(you)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)全部基(ji)(ji)因(yin)(yin)，能夠(gou)在(zai)(zai)宿(su)主菌(jun)中穩(wen)定地復制和(he)傳代，以作為種(zhong)子(zi)批保(bao)存。當構(gou)建嵌(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)時，在(zai)(zai)供(gong)體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)和(he)受體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)連(lian)接(jie)處，通(tong)過(guo)同義突變或(huo)者保(bao)守突變，為受體(ti)(ti)株(zhu)和(he)供(gong)體(ti)(ti)株(zhu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)添加合(he)(he)適的(de)(de)酶切位(wei)點，然后將兩者利用酶切位(wei)點連(lian)接(jie)起來，制備嵌(qian)合(he)(he)性(xing)克隆，體(ti)(ti)外經RNA聚(ju)合(he)(he)酶作用轉錄出嵌(qian)合(he)(he)性(xing)轉錄子(zi)，轉染細胞后重新獲得(de)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。這項技術(shu)的(de)(de)一個優點在(zai)(zai)于在(zai)(zai)它是在(zai)(zai)cDNA水平上(shang)的(de)(de)操(cao)作，突變率(lv)低、表型穩(wen)定，不(bu)像傳統(tong)疫苗研制過(guo)程中容易(yi)發生(sheng)(sheng)一系列的(de)(de)生(sheng)(sheng)物特(te)性(xing)改變。
克隆法
融合PCR 利用(yong)(yong)PCR技術制備(bei)嵌(qian)合病(bing)毒最(zui)大的(de)優點在(zai)于方便快捷，過去幾個(ge)月(yue)的(de)工作(zuo)現在(zai)幾天就能完成。目前生物(wu)技術產品日(ri)臻完善，不少公司推出高保真、熱(re)穩定性好的(de)逆轉(zhuan)錄酶(mei)(mei)和DNA聚(ju)(ju)合酶(mei)(mei)，如SuperscriptII逆轉(zhuan)錄酶(mei)(mei)、LAro~酶(mei)(mei)、Exraq酶(mei)(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚(ju)(ju)合酶(mei)(mei)系(xi)統等，利用(yong)(yong)這些酶(mei)(mei)可(ke)(ke)以有(you)效地擴增出病(bing)毒基因(yin)(yin)組大片(pian)段(>5kh)甚至全長的(de)cDNA。用(yong)(yong)4條引(yin)物(wu)、3次(ci)PCR可(ke)(ke)以把兩個(ge)異質基因(yin)(yin)片(pian)段連(lian)接(jie)在(zai)一起。另(ling)有(you)報道利用(yong)(yong)3個(ge)引(yin)物(wu)、兩次(ci)PCR即可(ke)(ke)制備(bei)嵌(qian)合基因(yin)(yin)，如YF—MOD嵌(qian)合病(bing)毒。
融合PCR
與(yu)克(ke)隆(long)技術(shu)相比較(jiao)，PCR方法更(geng)為(wei)靈活，可以選(xuan)擇任意位置進行(xing)嵌合；但是PCR具有(you)一定的(de)突(tu)變率，可能會(hui)帶來一些致死性突(tu)變而使轉錄體不具有(you)感染(ran)性，得(de)不到恢復(fu)病毒從(cong)而前(qian)功盡棄，所以現(xian)在大多數實驗還是采取克(ke)隆(long)法。
滅活(huo)病(bing)(bing)毒(du)之間的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)重(zhong)(zhong)組(zu)(zu) 是(shi)將兩種(zhong)或(huo)者兩種(zhong)以(yi)上的(de)(de)(de)滅活(huo)病(bing)(bing)毒(du)，在同(tong)一(yi)(yi)(yi)細胞內培(pei)養后(hou)，它們(men)之間發生(sheng)基(ji)因(yin)重(zhong)(zhong)組(zu)(zu)，有時會產生(sheng)感(gan)染性病(bing)(bing)毒(du)，這(zhe)種(zhong)方法又稱為多重(zhong)(zhong)復合，可(ke)(ke)能(neng)由于滅活(huo)病(bing)(bing)毒(du)受損的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)經(jing)重(zhong)(zhong)組(zu)(zu)后(hou)得以(yi)替(ti)補。如為了解包膜病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)融合活(huo)性，利(li)用黃熱病(bing)(bing)毒(du)YF一(yi)(yi)(yi)17DD和流感(gan)病(bing)(bing)毒(du)X31兩者不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)融合條件，以(yi)及核衣殼(ke)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)形(xing)態，將YF一(yi)(yi)(yi)17DD通(tong)過(guo)酸處(chu)理(li)失去(qu)融合活(huo)性，X31通(tong)過(guo)熱處(chu)理(li)滅活(huo)，兩者在YF一(yi)(yi)(yi)17DD滅活(huo)的(de)(de)(de)同(tong)一(yi)(yi)(yi)pH值下發生(sheng)融和反應(ying)，只有發生(sheng)融和反應(ying)的(de)(de)(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)具(ju)有感(gan)染性；流感(gan)病(bing)(bing)毒(du)提供功能(neng)型膜蛋白融合成分，YF一(yi)(yi)(yi)17DD提供功能(neng)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)，結果兩個滅活(huo)病(bing)(bing)毒(du)又重(zhong)(zhong)新(xin)(xin)構(gou)建成新(xin)(xin)的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)。這(zhe)項技術隨(sui)機性很大，但是(shi)可(ke)(ke)能(neng)得到(dao)意想(xiang)不(bu)到(dao)的(de)(de)(de)結果，可(ke)(ke)以(yi)用于病(bing)(bing)毒(du)功能(neng)的(de)(de)(de)研究。
黃熱病(bing)毒(du)(du)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)的構(gou)(gou)建(jian)(jian)前提(ti)在(zai)于，所(suo)有(you)(you)的黃熱病(bing)毒(du)(du)的病(bing)毒(du)(du)基因組的結(jie)構(gou)(gou)是高度保守的，它們(men)均為單股正鏈(lian)RNA病(bing)毒(du)(du)，基因組全長(chang)約l1kb，5端(duan)(duan)有(you)(you)帽子結(jie)構(gou)(gou)，3端(duan)(duan)無poly(A)尾，一個長(chang)的開(kai)放閱讀(du)框架(jia)覆蓋了大部(bu)分基因組，共編碼(ma)3個結(jie)構(gou)(gou)蛋(dan)白和(he)7個非結(jie)構(gou)(gou)蛋(dan)白，其(qi)(qi)中以E蛋(dan)白和(he)免疫(yi)原(yuan)性(xing)關系最為密切(qie)，所(suo)以構(gou)(gou)建(jian)(jian)的嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)一般都要(yao)取(qu)供體病(bing)毒(du)(du)的E基因；但(dan)并(bing)不是所(suo)有(you)(you)構(gou)(gou)建(jian)(jian)的嵌(qian)合(he)性(xing)cDNA克隆都具有(you)(you)感染性(xing)，其(qi)(qi)主(zhu)要(yao)影響因素如下。
技術(shu)方面 雖(sui)然現在(zai)工(gong)具(ju)酶的(de)保真性和效(xiao)率越(yue)來越(yue)好，但是(shi)黃熱病(bing)毒(du)長10kb以上，在(zai)基(ji)因操作(zuo)中不可避免有(you)(you)突(tu)變(bian)(bian)的(de)發生(sheng)，而有(you)(you)些(xie)突(tu)變(bian)(bian)是(shi)致死性突(tu)變(bian)(bian)，使得構建的(de)全長cDNA克(ke)隆或者嵌(qian)合體克(ke)隆沒有(you)(you)感染性。另外這些(xie)突(tu)變(bian)(bian)還影響恢復(fu)病(bing)毒(du)的(de)生(sheng)物學特性，如溫度敏感性、噬斑大(da)小、復(fu)制能(neng)力、嗜細(xi)胞能(neng)力都(dou)可能(neng)發生(sheng)改(gai)變(bian)(bian)。
技術方面
嵌(qian)合(he)位點(dian)(dian)(dian)(dian) 結(jie)構(gou)蛋白(bai)(bai)基因(yin)(yin)之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)連(lian)接處(chu)有一(yi)段(duan)(duan)親脂區(qu)(qu)序(xu)(xu)列，是構(gou)建嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)時將兩(liang)段(duan)(duan)異質核(he)苷酸(suan)序(xu)(xu)列進行連(lian)接的(de)(de)嵌(qian)合(he)位點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)，這(zhe)一(yi)段(duan)(duan)序(xu)(xu)列的(de)(de)保守性對于(yu)(yu)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)復制(zhi)能(neng)力(li)至關重要。如(ru)在(zai)prM和(he)(he)C基因(yin)(yin)之(zhi)(zhi)間(jian)有信號(hao)(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)以(yi)及(ji)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)，Cau—four等在(zai)構(gou)建YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)時選擇這(zhe)兩(liang)處(chu)作為(wei)嵌(qian)合(he)位點(dian)(dian)(dian)(dian)，結(jie)果在(zai)信號(hao)(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)嵌(qian)合(he)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)有感染(ran)性，而(er)在(zai)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)進行連(lian)接無(wu)法(fa)獲得病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，因(yin)(yin)為(wei)在(zai)兩(liang)個(ge)(ge)位點(dian)(dian)(dian)(dian)之(zhi)(zhi)間(jian)有一(yi)段(duan)(duan)親脂性的(de)(de)轉(zhuan)膜(mo)區(qu)(qu)，YFv這(zhe)一(yi)區(qu)(qu)域比DEN一(yi)2該區(qu)(qu)域要多(duo)6個(ge)(ge)氨(an)(an)基酸(suan)；在(zai)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合(he)體，由于(yu)(yu)這(zhe)一(yi)轉(zhuan)膜(mo)區(qu)(qu)缺少了6個(ge)(ge)氨(an)(an)基酸(suan)，蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)和(he)(he)信號(hao)(hao)肽(tai)酶(mei)(mei)不能(neng)正確識別切割位點(dian)(dian)(dian)(dian)，從而(er)影響prM蛋白(bai)(bai)和(he)(he)E蛋白(bai)(bai)的(de)(de)成(cheng)熟，病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)復制(zhi)過程受到阻礙，病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)顆粒沒(mei)法(fa)進行正常(chang)的(de)(de)包裝(zhuang)，所以(yi)無(wu)法(fa)分(fen)泌出病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)顆粒。
嵌合位點
供體病(bing)毒(du)(du)(du)(du)基因(yin) 目前(qian)構(gou)建的(de)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)多為供體株(zhu)(zhu)提供P和(he)(he)E基因(yin)，人們也嘗(chang)試過替代(dai)C基因(yin)或者部分基因(yin)，但多數(shu)沒有成功(gong)，其(qi)可能(neng)(neng)的(de)原因(yin)是位(wei)(wei)于(yu)C蛋(dan)白區域的(de)保守序(xu)列與受(shou)體株(zhu)(zhu)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)順式結構(gou)不(bu)相(xiang)容性，進(jin)而對(dui)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)RNA的(de)復制(zhi)產生了毒(du)(du)(du)(du)性，如Kuniin病(bing)毒(du)(du)(du)(du)RNA復制(zhi)必須有同源C蛋(dan)白上的(de)第(di)2位(wei)(wei)和(he)(he)第(di)20位(wei)(wei)氨基酸的(de)存，而異(yi)質基因(yin)的(de)C蛋(dan)白不(bu)能(neng)(neng)協助Kunjin病(bing)毒(du)(du)(du)(du)復制(zhi)，所以(yi)無(wu)法長成病(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆粒；另外也可能(neng)(neng)是異(yi)質病(bing)毒(du)(du)(du)(du)之間的(de)蛋(dan)白酶識別對(dui)方序(xu)列的(de)能(neng)(neng)力低下(xia)，對(dui)于(yu)C—prM部位(wei)(wei)的(de)切割效(xiao)率低，影(ying)響病(bing)毒(du)(du)(du)(du)正常的(de)裝配和(he)(he)釋放(fang)能(neng)(neng)力。
供體病毒
受(shou)體病(bing)毒基(ji)(ji)因 作(zuo)為(wei)(wei)嵌合(he)(he)(he)病(bing)毒載體，嵌合(he)(he)(he)病(bing)毒中(zhong)(zhong)的(de)(de)大部分基(ji)(ji)因由受(shou)體株提供，嵌合(he)(he)(he)病(bing)毒的(de)(de)復(fu)制(zhi)(zhi)特性(xing)也主要由受(shou)體株的(de)(de)基(ji)(ji)因控制(zhi)(zhi)，其(qi)中(zhong)(zhong)有(you)些序(xu)(xu)列對于嵌合(he)(he)(he)體的(de)(de)感(gan)染性(xing)有(you)決定性(xing)作(zuo)用，在(zai)(zai)構(gou)建嵌合(he)(he)(he)體時(shi)，如果這部分序(xu)(xu)列受(shou)到破壞，就不能夠獲得恢(hui)復(fu)病(bing)毒。如在(zai)(zai)構(gou)建DEN一(yi)4和(he)WNV的(de)(de)嵌合(he)(he)(he)病(bing)毒時(shi)四，由WNVNY99的(de)(de)prM和(he)E基(ji)(ji)因代(dai)替DEN一(yi)4相應位(wei)(wei)置的(de)(de)基(ji)(ji)因，在(zai)(zai)構(gou)建的(de)(de)18個(ge)(ge)克(ke)隆中(zhong)(zhong)僅有(you)兩(liang)個(ge)(ge)具(ju)有(you)感(gan)染性(xing)，序(xu)(xu)列比較發現這兩(liang)個(ge)(ge)克(ke)隆在(zai)(zai)prM和(he)C蛋白之(zhi)間(jian)的(de)(de)NS2A—NS2B蛋白酶(mei)切(qie)割位(wei)(wei)點下游(you)(you)，在(zai)(zai)轉膜信號區域中(zhong)(zhong)都包含一(yi)基(ji)(ji)序(xu)(xu)，這一(yi)基(ji)(ji)序(xu)(xu)是酶(mei)切(qie)割位(wei)(wei)點下游(you)(you)的(de)(de)第3位(wei)(wei)及(ji)第6位(wei)(wei)分別為(wei)(wei)天冬氨(an)酸(suan)和(he)蘇氨(an)酸(suan)，另外16個(ge)(ge)克(ke)隆則沒有(you)該位(wei)(wei)點，實驗表明這兩(liang)個(ge)(ge)位(wei)(wei)點似乎和(he)嵌合(he)(he)(he)性(xing)克(ke)隆的(de)(de)感(gan)染性(xing)有(you)關。
受體病毒
嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個最大特點是(shi)表型多發生變(bian)化，如復制(zhi)能(neng)(neng)力(li)、毒(du)(du)力(li)、抗原性(xing)等，可能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)原因(yin)是(shi)由于缺乏校正功(gong)能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)聚合(he)(he)酶存在，而有(you)異質基因(yin)的(de)(de)(de)(de)正鏈RNA病(bing)毒(du)(du)，在病(bing)毒(du)(du)復制(zhi)中具有(you)較高的(de)(de)(de)(de)基因(yin)突變(bian)率，并且這些(xie)突變(bian)為(wei)了適應不(bu)同的(de)(de)(de)(de)宿主(zhu)細胞，可能(neng)(neng)會發生一(yi)(yi)些(xie)特性(xing)改變(bian)，從而出現一(yi)(yi)些(xie)預想不(bu)到的(de)(de)(de)(de)結果。
生(sheng)長(chang)(chang)特性改變(bian)(bian)(bian) 嵌合(he)病毒(du)的兩(liang)個母體病毒(du)的易感細胞(bao)不同，得到的嵌合(he)病毒(du)在不同細胞(bao)中復制(zhi)時，由于(yu)缺乏(fa)有效(xiao)的復制(zhi)酶而引起生(sheng)長(chang)(chang)特性的改變(bian)(bian)(bian)，其嗜細胞(bao)性也會有所改變(bian)(bian)(bian)，另外噬(shi)斑(ban)試驗中噬(shi)斑(ban)形態
生長特性改變
大小都多有(you)變(bian)化。如Chimeri—JE嵌(qian)合體(ti)在(zai)(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)復(fu)(fu)制形式類似，而在(zai)(zai)MRC一(yi)5、FRhl細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)雖然病(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)能(neng)夠(gou)(gou)達到6log。0pfu/mL，但(dan)是(shi)卻不能(neng)產生CPE，這(zhe)些特性(xing)和(he)母體(ti)株YFV以及JEV都截然不同。LGT1和(he)E5是(shi)TBEV的兩個弱(ruo)毒(du)(du)(du)株，與DEN一(yi)4病(bing)毒(du)(du)(du)組成的嵌(qian)合體(ti)在(zai)(zai)猿(yuan)(yuan)猴細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)復(fu)(fu)制能(neng)力(li)(li)下降(jiang)，而轉(zhuan)染蚊蟲細胞(bao)(bao)(bao)復(fu)(fu)制能(neng)力(li)(li)不受影(ying)響，用在(zai)(zai)蚊蟲細胞(bao)(bao)(bao)傳(chuan)代的嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)(zai)猿(yuan)(yuan)猴細胞(bao)(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)(zhong)(zhong)不能(neng)夠(gou)(gou)形成噬斑，而在(zai)(zai)早期構(gou)建的DEN一(yi)4和(he)另一(yi)個TBEV病(bing)毒(du)(du)(du)株構(gou)建的嵌(qian)合體(ti)在(zai)(zai)猿(yuan)(yuan)猴細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)卻能(neng)夠(gou)(gou)得到比DEN一(yi)4病(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)高1000倍的嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)。
神(shen)經(jing)(jing)內毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)神(shen)經(jing)(jing)外(wai)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing) 神(shen)經(jing)(jing)內(外(wai))毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)低而(er)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)好是一(yi)個(ge)理(li)想疫(yi)(yi)(yi)苗應具(ju)備(bei)的(de)(de)(de)品質，許(xu)多(duo)實驗室經(jing)(jing)過(guo)多(duo)年研(yan)究(jiu)雖然篩檢(jian)出一(yi)些(xie)(xie)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)，但(dan)是兩(liang)(liang)者多(duo)不能達到(dao)有效的(de)(de)(de)統一(yi)。嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)技術以“取長補短(duan)”的(de)(de)(de)原則，將兩(liang)(liang)種病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)結合(he)(he)起來(lai)，以期研(yan)制理(li)想疫(yi)(yi)(yi)苗，就目前得到(dao)的(de)(de)(de)一(yi)些(xie)(xie)嵌合(he)(he)株(zhu)(zhu)來(lai)說，確實取得了一(yi)些(xie)(xie)令人滿意(yi)的(de)(de)(de)結果，如DEN一(yi)4和(he)WNV的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)與WNV相(xiang)比高度(du)減(jian)毒(du)(du)四，腦(nao)內接(jie)(jie)種戒奶(nai)小鼠(shu)，神(shen)經(jing)(jing)內毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)降(jiang)(jiang)低至1/28500；腹腔內接(jie)(jie)種小鼠(shu)，神(shen)經(jing)(jing)外(wai)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)下(xia)(xia)降(jiang)(jiang)至1/10000，免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)好，能安(an)全保護小鼠(shu)接(jie)(jie)受野生株(zhu)(zhu)攻(gong)擊。另外(wai)如ChimeriVax—JE嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)也(ye)較母體株(zhu)(zhu)YFV和(he)JEV呈大幅度(du)下(xia)(xia)降(jiang)(jiang)，而(er)單劑量又具(ju)備(bei)很好的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)保護力；還(huan)有DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)都(dou)有所下(xia)(xia)降(jiang)(jiang)，這(zhe)些(xie)(xie)嵌合(he)(he)體都(dou)在進一(yi)步的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)中。
神經(jing)內毒性和神經(jing)外毒性
基(ji)因穩(wen)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing) 因為RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)易以準(zhun)種的(de)(de)(de)形式(shi)出現和易變異的(de)(de)(de)特性(xing)(xing)，作為活疫苗來(lai)使用，一(yi)(yi)個重(zhong)要(yao)(yao)的(de)(de)(de)條件是(shi)(shi)基(ji)因型要(yao)(yao)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)，這一(yi)(yi)點是(shi)(shi)疫苗安全性(xing)(xing)的(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)表(biao)現。嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)通(tong)過(guo)返(fan)祖實驗檢定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)，即在(zai)乳(ru)鼠(shu)(shu)腦內和細(xi)胞(bao)中(zhong)進行(xing)培養，觀察有(you)無明顯(xian)表(biao)型變化，必要(yao)(yao)時進行(xing)核苷(gan)酸(suan)鑒(jian)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)，如(ru)ChimeriVax-JE嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)115．161在(zai)細(xi)胞(bao)內傳(chuan)(chuan)代(dai)l8次以及(ji)在(zai)乳(ru)鼠(shu)(shu)腦內傳(chuan)(chuan)代(dai)6次并(bing)沒有(you)毒(du)(du)(du)力的(de)(de)(de)回(hui)升，對減(jian)毒(du)(du)(du)位點進行(xing)測序也(ye)沒有(you)發(fa)生(sheng)(sheng)核苷(gan)酸(suan)改變。而有(you)的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)不夠(gou)好如(ru)DEN一(yi)(yi)2/DEN一(yi)(yi)4、DEN一(yi)(yi)2/DEN—l復制能(neng)力較(jiao)(jiao)弱(ruo)，而經(jing)過(guo)幾次傳(chuan)(chuan)代(dai)后得(de)到較(jiao)(jiao)高的(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴度，是(shi)(shi)因為發(fa)生(sheng)(sheng)了一(yi)(yi)些突變。在(zai)體外(wai)轉(zhuan)錄(lu)時產生(sheng)(sheng)了轉(zhuan)錄(lu)體的(de)(de)(de)雜和體，在(zai)轉(zhuan)染后經(jing)過(guo)細(xi)胞(bao)復制，復制能(neng)力增強的(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)逐漸占(zhan)主(zhu)(zhu)要(yao)(yao)優勢，在(zai)LLC—MK2細(xi)胞(bao)中(zhong)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)傳(chuan)(chuan)代(dai)可以保持較(jiao)(jiao)高的(de)(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)，所以在(zai)制備嵌(qian)合疫苗時，應(ying)盡量減(jian)少病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)哺乳(ru)動(dong)物細(xi)胞(bao)中(zhong)傳(chuan)(chuan)代(dai)的(de)(de)(de)次數。
基因穩定性
在(zai)黃(huang)熱病(bing)毒嵌(qian)合病(bing)毒發(fa)展的(de)這十(shi)幾年中，人們嘗試構建了(le)多種嵌(qian)合病(bing)毒，其中大部分(fen)是以(yi)制備疫苗為目的(de)，另(ling)外還用于(yu)病(bing)毒的(de)分(fen)子生物學(xue)特性研究。
分(fen)子生物學特性(xing)研(yan)(yan)究 型內(nei)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)可以用于了(le)解病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)復(fu)制(zhi)能力，進一(yi)(yi)步了(le)解各基(ji)因的(de)功能。如構(gou)建同(tong)(tong)型不同(tong)(tong)株之(zhi)間DEN一(yi)(yi)216681/PDK一(yi)(yi)53、DEN25ol/04株之(zhi)間的(de)型內(nei)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)，研(yan)(yan)究DEN一(yi)(yi)2型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結(jie)構(gou)蛋白區對(dui)乳鼠神經(jing)毒(du)(du)(du)性(xing)的(de)影響。可以用于推測病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)力位(wei)(wei)點，由2個JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株cDNA克隆提供(gong)5端，3個病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株cDNA提供(gong)的(de)3端進行(xing)組合(he)，感染(ran)細胞后(hou)重(zhong)新獲得6種重(zhong)組JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。根據噬菌斑大(da)小(xiao)篩(shai)選到3個減毒(du)(du)(du)株，比(bi)較(jiao)(jiao)6種重(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株和野生株的(de)基(ji)因序列，發現僅僅是(shi)E138(Glu—Lys)一(yi)(yi)個氨基(ji)酸位(wei)(wei)點不同(tong)(tong)，說(shuo)明這個位(wei)(wei)點和毒(du)(du)(du)力之(zhi)間關系(xi)密切；另外發現該(gai)突(tu)變株雖然(ran)毒(du)(du)(du)性(xing)降低，但是(shi)腦(nao)內(nei)注射接(jie)種小(xiao)鼠后(hou)仍能在(zai)腦(nao)內(nei)復(fu)制(zhi)，但是(shi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)比(bi)較(jiao)(jiao)低，看(kan)來其(qi)減毒(du)(du)(du)機(ji)(ji)制(zhi)不在(zai)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復(fu)制(zhi)，而可能是(shi)影響復(fu)制(zhi)的(de)早期機(ji)(ji)制(zhi)，在(zai)細胞之(zhi)間傳遞(di)速(su)度(du)比(bi)較(jiao)(jiao)慢，從而使免疫(yi)系(xi)統(tong)能及時清除(chu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
分子(zi)生物學特性研(yan)究
型(xing)間嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)也(ye)(ye)可以用于分子生(sheng)物學(xue)(xue)特(te)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)研究，如(ru)黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)和(he)(he)日(ri)本腦炎病(bing)毒(du)(du)(du)雖然(ran)同(tong)屬黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)屬，但(dan)是有(you)很(hen)多(duo)生(sheng)物學(xue)(xue)特(te)性(xing)(xing)(xing)(xing)都不盡相同(tong)，如(ru)抗原性(xing)(xing)(xing)(xing)相差很(hen)遠(yuan)、中(zhong)間宿主不同(tong)、引起人(ren)體發(fa)病(bing)的(de)(de)癥狀也(ye)(ye)截然(ran)不同(tong)；兩者雖然(ran)從同(tong)一病(bing)毒(du)(du)(du)得(de)來(lai)，但(dan)是在進化的(de)(de)過(guo)程中(zhong)發(fa)生(sheng)了很(hen)大的(de)(de)變(bian)化，構建(jian)的(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)YF/JE(S)其生(sheng)物學(xue)(xue)特(te)性(xing)(xing)(xing)(xing)也(ye)(ye)有(you)所(suo)改變(bian)，如(ru)神(shen)經內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)神(shen)經外毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)都有(you)所(suo)降低(di)，和(he)(he)其供體株SAl4一l4—2相似(si)；而構建(jian)的(de)(de)另一個嵌(qian)合(he)株YF/JE(N)神(shen)經毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)卻很(hen)高(gao)，和(he)(he)供體株Nakayama特(te)性(xing)(xing)(xing)(xing)一致；這說(shuo)明(ming)確實如(ru)原先預料，和(he)(he)減毒(du)(du)(du)有(you)關的(de)(de)表位(wei)主要存在E蛋(dan)白(bai)(bai)中(zhong)，而同(tong)時也(ye)(ye)發(fa)現(xian)，和(he)(he)原來(lai)的(de)(de)SA14-14-2相比較(jiao)，嵌(qian)合(he)株在細胞中(zhong)復制能力(li)升高(gao)，病(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度較(jiao)高(gao)，免疫原性(xing)(xing)(xing)(xing)增加，這又說(shuo)明(ming)是YF一17DD病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)非結構蛋(dan)白(bai)(bai)發(fa)揮作用。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合(he)病毒
候選疫苗
日本腦(nao)炎(yan)是一(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)影(ying)響中(zhong)樞神(shen)經(jing)(jing)系統的(de)(de)(de)(de)疾病，主(zhu)要流行于亞洲，但是近年(nian)(nian)在澳洲、美洲也有病例(li)發(fa)生，每年(nian)(nian)官方(fang)報(bao)道全球有5萬病例(li)，其中(zhong)有l萬例(li)是致死性(xing)的(de)(de)(de)(de)；雖(sui)然目(mu)前有活疫(yi)苗(miao)(miao)、滅活疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)(de)(de)使用(yong)，但是這些(xie)疫(yi)苗(miao)(miao)具有免疫(yi)原性(xing)不(bu)夠、價格(ge)偏高、制作工(gong)藝(yi)不(bu)被(bei)WHO認可等(deng)劣勢，所(suo)以還有必(bi)要開發(fa)研制新疫(yi)苗(miao)(miao)。1999年(nian)(nian)Chambers等(deng)以SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)prM和E基因代替YF一(yi)17DD疫(yi)苗(miao)(miao)株的(de)(de)(de)(de)相應基因構建了嵌(qian)合(he)病毒(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病毒(du)能在WHO認可的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞中(zhong)很好地被(bei)培(pei)養，恢復病毒(du)和YF一(yi)17DD、SA14—14-2相比(bi)較，以6log0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病毒(du)腦(nao)內(nei)接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)3-4周(zhou)齡(ling)小鼠(shu)無一(yi)例(li)發(fa)病，而接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)(de)小鼠(shu)全部死亡；另外用(yong)3．2log0pfu劑(ji)量(liang)的(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，能在85%一(yi)95%的(de)(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)者(zhe)中(zhong)產生中(zhong)和抗(kang)體，抗(kang)體平均滴度能夠達(da)(da)(da)到PRNT~o<30，血(xue)清陽轉率小于80%；而接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)疫(yi)苗(miao)(miao)后，能夠達(da)(da)(da)到100%的(de)(de)(de)(de)血(xue)清陽轉率，接(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)后30dPRNT能夠達(da)(da)(da)到129~327，這些(xie)結果(guo)表明構建的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病毒(du)神(shen)經(jing)(jing)內(nei)毒(du)性(xing)呈大幅度降低；用(yong)乳鼠(shu)以及猴(hou)子進(jin)行安全試(shi)驗(yan)檢測，進(jin)一(yi)步證實了該病毒(du)的(de)(de)(de)(de)弱神(shen)經(jing)(jing)毒(du)性(xing)，內(nei)臟毒(du)性(xing)也下降。目(mu)前該疫(yi)苗(miao)(miao)已(yi)經(jing)(jing)通過一(yi)期臨床試(shi)驗(yan)，是很有前途(tu)的(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)(miao)候選(xuan)株。
登革病毒多價疫苗
登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)是(shi)目前誘(you)發(fa)(fa)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)最多(duo)的(de)(de)黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)，在人(ren)口聚集的(de)(de)熱帶及亞熱帶時(shi)有(you)爆(bao)發(fa)(fa)，因(yin)(yin)為(wei)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)4個血清型之間可以產(chan)生(sheng)交叉保護力(li)(li)，所以感染(ran)一種(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)后(hou)，能(neng)夠對另外3種(zhong)血清型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)抗體反應。在機體遭受另一種(zhong)血清型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)感染(ran)后(hou)，由(you)于抗體依賴的(de)(de)復制能(neng)力(li)(li)增強作(zuo)用可能(neng)誘(you)發(fa)(fa)DHF/DSS的(de)(de)發(fa)(fa)生(sheng)，因(yin)(yin)此理(li)想的(de)(de)疫苗(miao)應該(gai)能(neng)夠產(chan)生(sheng)針(zhen)對4個型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)中和(he)(he)抗體和(he)(he)T細胞免疫。目前主要有(you)兩個實(shi)驗室分別以DEN一2PDK一53和(he)(he)YF一17DD作(zuo)為(wei)受體株構建了包括DEN一1到DEN-4型的(de)(de)嵌合株，結果有(you)很好的(de)(de)免疫原性(xing)、較高的(de)(de)復制效(xiao)(xiao)率和(he)(he)穩定性(xing)，在動物實(shi)驗中證(zheng)明毒(du)性(xing)減低，小鼠(shu)效(xiao)(xiao)力(li)(li)實(shi)驗安全(quan)有(you)效(xiao)(xiao)，有(you)望成(cheng)為(wei)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)疫苗(miao)的(de)(de)發(fa)(fa)展方向。
另外還有(you)YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)(de)報道，都出(chu)現一些令(ling)人(ren)(ren)滿意的(de)(de)特(te)性(xing)，進一步研究正在進行(xing)中。嵌(qian)合病毒(du)的(de)(de)出(chu)現是獲(huo)得減毒(du)活疫(yi)苗的(de)(de)一個新途徑，和傳統方法相(xiang)比具有(you)目標(biao)明確(que)、免疫(yi)效果好(hao)、減毒(du)穩定(ding)的(de)(de)優勢，但該技術目前還處于探(tan)索階段，有(you)時(shi)結果很出(chu)人(ren)(ren)意料，所(suo)以在構建一個新的(de)(de)嵌(qian)合體(ti)時(shi)，要時(shi)刻注意安全性(xing)問題(ti)，否則(ze)會適得其反，創造(zao)出(chu)新的(de)(de)毒(du)性(xing)更強的(de)(de)病毒(du)，為人(ren)(ren)類帶(dai)來危(wei)害。
嵌(qian)合疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)是應(ying)用(yong)基(ji)因(yin)工程手段構建基(ji)因(yin)能表達(da)兩種以上病(bing)(bing)(bing)原體抗原的一類新型疫(yi)(yi)(yi)苗(miao),應(ying)用(yong)嵌(qian)合疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)可解決多(duo)次接種問(wen)題。本文(wen)綜(zong)述(shu)了目前(qian)世界一些國家研制的嵌(qian)合疫(yi)(yi)(yi)苗(miao),如(ru)登革病(bing)(bing)(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)、呼吸道(dao)合胞病(bing)(bing)(bing)毒(du)、副(fu)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)、人(ren)類免疫(yi)(yi)(yi)缺陷病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)及(ji)人(ren)乳頭(tou)瘤病(bing)(bing)(bing)毒(du)等相關(guan)嵌(qian)合疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)的研究(jiu)策(ce)略和方法、免疫(yi)(yi)(yi)學評價及(ji)其應(ying)用(yong)前(qian)景(jing)。
精靈世(shi)界
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