一、膠原酶簡介

膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)按(an)其(qi)存(cun)(cun)在的(de)方式不(bu)同(tong)可(ke)(ke)分(fen)為人(ren)體(ti)內源性膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)和藥用膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)兩種(zhong)。人(ren)體(ti)內源性膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)是(shi)指(zhi)人(ren)體(ti)內部本身(shen)所具有的(de)膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)，如(ru)牙(ya)齦、觸膜(mo)等上皮(pi)組織和關節滑膜(mo)、椎間盤內都不(bu)同(tong)程度的(de)存(cun)(cun)在著(zhu)這(zhe)種(zhong)膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)，它(ta)在體(ti)內膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)蛋(dan)白的(de)分(fen)解過程中發揮著(zhu)不(bu)可(ke)(ke)或缺的(de)作(zuo)用。藥用膠(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)是(shi)指(zhi)利用生物制藥的(de)高科技手段從溶組織梭狀(zhuang)芽孢桿菌(jun)(jun)的(de)發酵液中提取、純化并精制而得的(de)白色或類白色無菌(jun)(jun)凍干(gan)粉針生物制劑。

膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)（collagenase）是從(cong)溶組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)梭狀細(xi)胞芽(ya)孢(bao)桿菌(jun)提(ti)取制(zhi)備的(de)(de)，主要水解(jie)結(jie)締組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)中膠(jiao)原(yuan)(yuan)蛋(dan)白成分(fen)(fen)(fen)。當擬消(xiao)化(hua)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)較(jiao)硬(ying)，內(nei)含(han)較(jiao)多結(jie)締組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)或(huo)膠(jiao)原(yuan)(yuan)成分(fen)(fen)(fen)時，用(yong)胰蛋(dan)白酶(mei)解(jie)離(li)(li)(li)細(xi)胞的(de)(de)效果較(jiao)差(cha)，這(zhe)時可采用(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)解(jie)離(li)(li)(li)細(xi)胞法。 膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)僅對細(xi)胞間質有消(xiao)化(hua)作(zuo)用(yong)而對上皮細(xi)胞影響不大。因(yin)此適于(yu)消(xiao)化(hua)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)纖維性(xing)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)、上皮及癌組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，可使上皮細(xi)胞與膠(jiao)原(yuan)(yuan)成分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)而不受損害。常用(yong)劑量為(wei)最終濃度(du)200U/ml（約為(wei)1mg/mL）或(huo)0.03%~0.3%。膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)分(fen)(fen)(fen)為(wei)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xi)胞專(zhuan)用(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)，要根據(ju)所(suo)要分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)消(xiao)化(hua)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)類(lei)型選擇膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)類(lei)型。

1、膠原(yuan)酶(mei)Ⅰ用(yong)于上皮(pi)、肺，脂肪和(he)腎上腺組織細(xi)胞的分離(li)。用(yong)于消化組織中連接部分使其成為單個細(xi)胞，用(yong)于哺(bu)乳動(dong)細(xi)胞的分離(li)。

2、膠原酶Ⅳ包含至少(shao)7種蛋白酶成分(fen)，分(fen)子量從(cong)68-130KD不等。它能消化多(duo)種組織。

3、膠原酶(mei)Ⅴ包含至少7種蛋白(bai)酶(mei)成(cheng)分(fen)(fen)，分(fen)(fen)子量(liang)從(cong)68-130KD不(bu)等。它可(ke)用于胰腺小(xiao)島組織(zhi)的分(fen)(fen)離，將結締組織(zhi)分(fen)(fen)離成(cheng)單個(ge)細(xi)胞。

4、膠原酶Ⅱ適用于肝臟(zang)，骨，甲狀(zhuang)腺，心(xin)臟(zang)和唾液腺組織。

二、如何配置膠原酶

膠原酶溶(rong)液同(tong)胰(yi)蛋白酶一(yi)樣配制、消毒滅菌和儲藏(zang)。

注(zhu)意：因為Ⅰ型膠原(yuan)酶(mei)分子顆粒比胰酶(mei)大，不(bu)容易過濾，因此可(ke)以用(yong)蔡式(shi)濾器過濾除菌。 　　鈣、鎂離子和血清成分不(bu)會影(ying)響膠原(yuan)酶(mei)的消(xiao)化作(zuo)用(yong)，因而可(ke)用(yong)BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配制。

三、膠原酶的使用

1、將漂洗、修剪干凈的(de)組織剪成1~2mm左右小塊。

2、將組(zu)織塊放入(ru)離(li)心(xin)管（三(san)角燒(shao)(shao)瓶(ping)）中加入(ru)30~50倍體積的膠(jiao)原酶溶液，旋(xuan)緊蓋子（密封燒(shao)(shao)瓶(ping)）。

3、將燒瓶(ping)放(fang)入(ru)37℃水浴或(huo)者37℃孵箱內(nei)，每隔3min振搖(yao)(yao)一次(ci)，如能(neng)(neng)放(fang)在(zai)37℃的(de)(de)恒(heng)溫震蕩水浴箱中則(ze)更(geng)好。消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)時間與組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)的(de)(de)類別很有(you)關系，對于(yu)(yu)某些腫瘤(liu)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)或(huo)其(qi)他較致密結締組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)時間4~48h，對于(yu)(yu)容易(yi)消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)可以(yi)(yi)采(cai)用37℃震蕩消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)15~45min，也(ye)可以(yi)(yi)根據具(ju)體情況而定(ding)。如組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)塊(kuai)已分散(san)而失去塊(kuai)的(de)(de)形狀，一經搖(yao)(yao)動即成(cheng)(cheng)細胞(bao)(bao)團(tuan)或(huo)單個(ge)細胞(bao)(bao)，可以(yi)(yi)認為已消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)充分。上(shang)皮組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)經膠原酶(mei)消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)后，由(you)于(yu)(yu)上(shang)皮細胞(bao)(bao)對此酶(mei)有(you)耐受性，可能(neng)(neng)仍有(you)一些細胞(bao)(bao)團(tuan)未完全(quan)分散(san)，但成(cheng)(cheng)團(tuan)的(de)(de)上(shang)皮細胞(bao)(bao)比分散(san)的(de)(de)單個(ge)上(shang)皮細胞(bao)(bao)更(geng)易(yi)生(sheng)長，因(yin)此，如無特(te)殊需要可以(yi)(yi)不必(bi)再(zai)進(jin)一步處理。

4、收(shou)集消(xiao)化液(ye)（有時含個別組織塊及沒有充分消(xiao)化的組織碎屑則需用100目(mu)不銹鋼網過濾(lv)），離心1000r/min，5min，去除(chu)(chu)上清，用Hanks液(ye)或者(zhe)無血清培養液(ye)離心漂(piao)洗(xi)1~2次，去除(chu)(chu)上清，加培養液(ye)制成(cheng)細胞懸液(ye)，接種(zhong)培養瓶。