【基因檢測方法比較】基因檢測方法有哪些 基因檢測技術原理

1、第一代測序

1.1 Sanger測序采用的是直接測序法

1977年，Frederick Sanger等發明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術隨后成為最為常用的基因測序技術。2001年，Allan Maxam和(he)Walter Gibert發明了(le)Sanger測序法(fa)，并在此后的10年里成(cheng)為基因檢測(ce)的金標準。其基本原理(li)即雙脫(tuo)氧核(he)苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每當DNA鏈(lian)加入分子ddNTP，延(yan)伸便(bian)終止。每一次DNA測序是由4個(ge)獨立的反應組成(cheng)，將模板、引物和4種含有不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)放射性(xing)同(tong)(tong)位素標記的(de)(de)核苷酸的(de)(de)ddNTP分別與DNA聚合酶混合形成長短不一的(de)片段，大量起始點(dian)相(xiang)同、終止(zhi)點(dian)不同的(de)DNA片(pian)段存(cun)在于反應體系中，具有單(dan)個堿基(ji)差(cha)別的DNA序列可(ke)以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來，得到放(fang)射性同位素(su)自顯影條帶。依據(ju)電泳條帶讀取DNA雙鏈的(de)堿基序列。

人類(lei)基(ji)因組的測序正(zheng)是基(ji)于該技術(shu)完成(cheng)的。Sanger測序這種直接(jie)測序方法具有(you)高度的準(zhun)確性和簡單、快(kuai)捷等特點。目前，依然對于一(yi)些臨(lin)床上(shang)小樣本(ben)遺傳疾病(bing)基因(yin)的鑒(jian)定具有(you)很高的實用價值。例如，臨(lin)床上(shang)采用Sanger直(zhi)接測序FGFR 2基因(yin)證實單基因(yin)Apert綜合征和直接測序TCOF1基(ji)因可以檢出多達90%的與Treacher Collins綜合征相關的突(tu)變。值得注意的是，Sanger測序是(shi)針對已知(zhi)致病基因的突變位點設計引物，進(jin)行PCR直接(jie)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)測序。單個突變點的擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)包括該位點在內的外顯子(zi)片段(duan)即可(ke)，不必將該點所在基因的全部外顯子(zi)都(dou)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)。

因此，應明(ming)確定(ding)位(wei)要擴增的位(wei)點(dian)所(suo)在(zai)的基(ji)因外顯子和該點(dian)的具(ju)體位(wei)置，設(she)計包括該點(dian)在(zai)內的上下游150~200 bp的外顯子片(pian)段引物(wu)。此外，盡管有NGS的出現，但Sanger測序(xu)對于有(you)致病基(ji)因(yin)位點明確并且數量有(you)限的(de)單基(ji)因(yin)遺(yi)傳疾病的(de)致病基(ji)因(yin)的(de)檢(jian)測是非常經濟(ji)和高效的(de)。到目前為止，Sanger測(ce)序仍(reng)然是(shi)作為基因(yin)檢測(ce)的金標準，也是(shi)NGS基因(yin)檢測(ce)后進行家系內和正常對照(zhao)組驗證的主要手(shou)段。

值得注(zhu)意(yi)的是，Sanger測序目的(de)(de)(de)(de)是尋找(zhao)與疾病(bing)有關的(de)(de)(de)(de)特定的(de)(de)(de)(de)基(ji)因突變。對于沒有明確候選基(ji)因或候選基(ji)因數量較多的(de)(de)(de)(de)大樣本病(bing)例篩查是難以完(wan)成的(de)(de)(de)(de)，此類(lei)測序研(yan)究還要(yao)依靠具有高(gao)通量測序能力的(de)(de)(de)(de)NGS。雖然Sanger測(ce)序具有高度的(de)分析準確(que)性，但其準確(que)性還取決于測(ce)序儀(yi)器以及測(ce)序條(tiao)件的(de)設定。另外，Sanger測(ce)序不能(neng)檢測(ce)出大(da)片(pian)段缺失(shi)或拷貝(bei)數變異(yi)等基(ji)因突變的類型，因此對于一些與此相(xiang)關的遺傳性(xing)疾病還(huan)不能(neng)做出基(ji)因學診(zhen)斷。

1.2連鎖分析采用的是間接測序法

在NGS出(chu)(chu)現之前，國際通(tong)用(yong)的(de)(de)疾病基(ji)(ji)因定位克(ke)(ke)隆(long)策略(lve)是(shi)建立在(zai)大規模全基(ji)(ji)因掃描和連鎖分析基(ji)(ji)礎上(shang)的(de)(de)位置(zhi)候選(xuan)基(ji)(ji)因克(ke)(ke)隆(long)。人類的(de)(de)染(ran)(ran)色體(ti)成對出(chu)(chu)現，一條來自父(fu)親，一條來自母親，每一對染(ran)(ran)色體(ti)在(zai)同樣的(de)(de)位置(zhi)上(shang)擁有相同的(de)(de)基(ji)(ji)因，但是(shi)其序列并(bing)不完全相同，被稱(cheng)為父(fu)系(xi)和母系(xi)等(deng)位基(ji)(ji)因。

遺傳標記是指在人(ren)群中表現出多態現象的DNA序列(lie)，可(ke)(ke)追蹤(zong)染色體(ti)、染色體(ti)某一(yi)節(jie)段或某個(ge)基因座在(zai)家(jia)系中傳遞的(de)任何一(yi)種遺(yi)(yi)傳特性。它存(cun)在(zai)于每一(yi)個(ge)人，但(dan)大小和(he)序列(lie)有差別，具(ju)有可(ke)(ke)遺(yi)(yi)傳性和(he)可(ke)(ke)識(shi)別性。目前采用(yong)第二代遺(yi)(yi)傳標(biao)(biao)記(ji)，即重(zhong)復(fu)序列(lie)多態性，特別是(shi)短串(chuan)聯(lian)重(zhong)復(fu)序列(lie)，又稱微衛星(xing)標(biao)(biao)記(ji)。

連(lian)(lian)鎖(suo)分析是(shi)以(yi)(yi)連(lian)(lian)鎖(suo)這(zhe)種遺傳現象為基(ji)礎(chu)，研(yan)究(jiu)致病基(ji)因(yin)(yin)(yin)與遺傳性(xing)標記之間關(guan)系(xi)(xi)的(de)方法。如果(guo)控制某一表(biao)型性(xing)狀(zhuang)的(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)附近(jin)存(cun)在(zai)遺傳標記，那(nei)么利(li)用(yong)某個遺傳標記與某個擬定(ding)(ding)位的(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)之間是(shi)否存(cun)在(zai)連(lian)(lian)鎖(suo)關(guan)系(xi)(xi)，以(yi)(yi)及連(lian)(lian)鎖(suo)的(de)緊密程度就能將該基(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位到染色體某一位置上(shang)。1986年(nian)Morton等提出優(you)勢(shi)對數記分法(fa)(log odds score method，LOD)，主要檢測兩基因以(yi)某一重組率連鎖(suo)時的似(si)然性。LOD值為正，支持(chi)連鎖；LOD值為負，則否定連(lian)鎖(suo)。通過(guo)計(ji)算家系(xi)中的(de)微(wei)衛星(xing)標記與(yu)致病位點之間的(de)LOD值，可以初步估算二(er)者間的遺傳距離及連鎖程度，從而確定(ding)(ding)該基(ji)因(yin)在(zai)染(ran)色體上的粗(cu)略位(wei)(wei)(wei)置。然后利用該區域(yu)的染(ran)色體基(ji)因(yin)圖譜，分(fen)析定(ding)(ding)位(wei)(wei)(wei)區域(yu)內所有基(ji)因(yin)的功(gong)能與表達(da)，選擇(ze)合適(shi)的候選基(ji)因(yin)進行突(tu)變(bian)檢測，最終將致病基(ji)因(yin)定(ding)(ding)位(wei)(wei)(wei)或克(ke)隆。

然而，采用連鎖(suo)分析(xi)進行基因檢測存在(zai)很(hen)大的局限性。不(bu)但所需遺(yi)傳樣本(ben)量較大，一(yi)般要求提供(gong)三(san)代及(ji)以上遺(yi)傳家系患者(zhe)血(xue)樣，而且數據量大、處(chu)理復雜、產出速度較慢、定(ding)位不(bu)夠精確(一(yi)般只能定位在染色體某(mou)一(yi)區(qu)間)，這(zhe)就使得研究工作繁重和定位(wei)基因的(de)(de)時間周期特別長(chang)。目前(qian)，連鎖分析采用的(de)(de)單(dan)核苷酸多肽性(xing)(xing)和短串聯重復序列還在(zai)(zai)(zai)使用，但經典的(de)(de)間接測序方法，如單(dan)鏈(lian)構象多肽性(xing)(xing)、變性(xing)(xing)梯度凝膠(jiao)電泳和異源雙(shuang)鏈(lian)分析在(zai)(zai)(zai)美(mei)國(guo)(guo)已被淘(tao)汰(tai)，而在(zai)(zai)(zai)發展中國(guo)(guo)家作為研究手段還在(zai)(zai)(zai)有(you)限使用。

2、新一代測序(NGS)

主要包括(kuo)全基因組重測序(whole-genomesequencing，WGS)、全(quan)外顯(xian)子組測序(whole-exomesequencing，WES)和目標區域(yu)測(ce)序(Targeted regionssequencing，TRS)，它們同(tong)屬(shu)于新一代測序技術(shu)。總體而言，NGS技術(shu)具有(you)通量(liang)大、時(shi)間(jian)(jian)短、精確度(du)高(gao)和(he)(he)信息量(liang)豐富等(deng)優點，使得遺傳學者(zhe)可以(yi)在(zai)短時(shi)間(jian)(jian)內(nei)對(dui)感(gan)興趣的(de)基(ji)因進行(xing)精確定位。但這些不同(tong)的(de)測序(xu)技術(shu)在(zai)測序(xu)范圍、數據分析(xi)量(liang)以(yi)及測序(xu)費用(yong)和(he)(he)時(shi)間(jian)(jian)等(deng)方面又有(you)很大差別，如果選擇適合的(de)方法，對(dui)于(yu)臨床(chuang)診斷(duan)和(he)(he)科學研究將起到(dao)事半功倍的(de)作(zuo)用(yong)。

2.1目標區域測序目前常用的是基因芯片技術

其測序原(yuan)理是基于DNA雜交原理，利用目標基因組(zu)區域定制的(de)探針與基因組(zu)DNA進行(xing)芯片雜交或溶液(ye)雜交，將(jiang)目標基(ji)因區域DNA富(fu)集(ji)，再通(tong)過NGS技術進行測(ce)序。其測(ce)序過程是通過把數以(yi)萬計的cDNA或寡(gua)聚核(he)苷酸置于芯片上制成列(lie)陣，將(jiang)芯片上固定好的(de)(de)已知序(xu)列(lie)的(de)(de)核(he)苷酸探針與(yu)溶液中含有熒光(guang)標(biao)記的(de)(de)相應核(he)酸序(xu)列(lie)進行互補配對，根(gen)據(ju)測(ce)序(xu)儀所顯示強熒光(guang)的(de)(de)位(wei)置和強度，獲取每組點陣列(lie)信息，再利用(yong)生(sheng)物信息學算法確定目(mu)的(de)(de)靶核(he)苷酸的(de)(de)序(xu)列(lie)組成。測(ce)序(xu)所選(xuan)定的(de)(de)目(mu)標(biao)區域可以是連續(xu)的(de)(de)DNA序(xu)列，也可(ke)以(yi)是分(fen)布在同(tong)一(yi)(yi)個(ge)染(ran)色體不(bu)同(tong)區(qu)(qu)域(yu)或不(bu)同(tong)染(ran)色體上(shang)的(de)片段(duan)。目標(biao)區(qu)(qu)域(yu)測(ce)(ce)序(xu)技術，對于(yu)以(yi)往通過連鎖分(fen)析將基(ji)因突(tu)變鎖定在染(ran)色體某一(yi)(yi)片段(duan)區(qu)(qu)域(yu)內，但無法找出(chu)突(tu)變是一(yi)(yi)個(ge)非常好的(de)進一(yi)(yi)步檢測(ce)(ce)手段(duan)。2010年，Nicholas等使用基(ji)因分型(xing)芯(xin)片聯合連鎖分析技(ji)術(shu)，成功發現頭(tou)小畸形的新基(ji)因WDR62，文章發表在(zai)《NatGenet》雜志。類似的(de)研究在(zai)家族性胰腺癌中確(que)定8個候(hou)選變異位點和在家族性(xing)滲出性(xing)玻璃體視(shi)網膜病變發現易感(gan)基因TSPAN12。

基(ji)(ji)(ji)(ji)因芯片測(ce)序(xu)技術可(ke)以將經(jing)過連鎖分(fen)(fen)析鎖定(ding)了目(mu)標(biao)范(fan)圍或經(jing)過全基(ji)(ji)(ji)(ji)因組篩選的(de)特(te)定(ding)基(ji)(ji)(ji)(ji)因或區域進行更(geng)深一(yi)層的(de)研(yan)究，是解(jie)決(jue)連鎖分(fen)(fen)析無法發現致病基(ji)(ji)(ji)(ji)因的(de)有效(xiao)手段。基(ji)(ji)(ji)(ji)因芯片技術對于已知(zhi)基(ji)(ji)(ji)(ji)因突變的(de)篩查具有明顯優勢，可(ke)以快速、全面地檢測(ce)出(chu)目(mu)標(biao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因突變。同時，由于目(mu)標(biao)區域受到了限(xian)制，測(ce)序(xu)范(fan)圍大(da)幅(fu)度減少(shao)，測(ce)序(xu)時間和費用相應降(jiang)低(di)。但基(ji)(ji)(ji)(ji)因芯片檢測(ce)所需(xu)要的(de)DNA的(de)量要大，由于(yu)已提取的(de)DNA存在降(jiang)解的(de)風險，用于基(ji)因芯片研究的(de)血標本最好是(shi)冰(bing)凍的(de)全血，這樣可以使(shi)用于檢(jian)測(ce)DNA的量有(you)充分保證。

2.2全外顯子組測序(WES)

外顯子組是單個(ge)個(ge)體的(de)基因組DNA上(shang)所有蛋(dan)白質編(bian)碼序(xu)列的(de)總合。人(ren)類外顯子(zi)組(zu)序(xu)列約占人(ren)類全(quan)部基因組(zu)序(xu)列的(de)1%，但大約包(bao)含85%的致病突變。WES是(shi)利(li)用序列捕獲技術將全外顯子區域DNA捕捉并富集后(hou)進行高(gao)通量測序的基因分析(xi)方法(fa)。采用的技(ji)術平臺(tai)主要是羅氏(shi)公司的SeqCap EZ全(quan)外(wai)顯子捕(bu)獲系(xi)統，Illumina公司的Solexa技術(shu)和Agilent公(gong)司(si)的SureSelect外顯子靶向序列富(fu)集系統。其(qi)捕獲的(de)目標(biao)區在(zai)34~62 M之間，不僅包括編碼(ma)區(qu)同時也加入了部(bu)分(fen)非編碼(ma)區(qu)。NGS的測序(xu)過程主要包括DNA測序(xu)文庫(ku)的制備(bei)、錨定橋接、PCR擴(kuo)增、單堿(jian)(jian)基延伸測序和(he)數據分析。研究者根據測序儀捕獲到在(zai)測序過程中(zhong)摻入(ru)有不同熒光(guang)標(biao)記堿(jian)(jian)基片(pian)段，經計算機將熒光(guang)信號(hao)轉(zhuan)化成不同顏(yan)色的測序峰圖和(he)堿(jian)(jian)基序列。基因測序結(jie)果與NCBI的SNP數據庫、千(qian)人基因組數據庫等(deng)國際權威數據庫比對，最終(zhong)確定是否為突變基因。

自(zi)NGS技術問世以(yi)來，利用(yong)WES在(zai)(zai)(zai)(zai)臨(lin)床疾(ji)病(bing)致病(bing)基因(yin)的鑒定研究中(zhong)(zhong)取(qu)得前所未有的成果(guo)。這些成果(guo)不僅集中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)(zai)(zai)單基因(yin)遺(yi)傳疾(ji)病(bing)，還在(zai)(zai)(zai)(zai)多基因(yin)影響(xiang)的復(fu)雜疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)獲(huo)得大(da)量相關基因(yin)的發現。在(zai)(zai)(zai)(zai)單基因(yin)遺(yi)傳性疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)，如視網膜色素變性、終端(duan)骨發育不良等(deng)發現新基因(yin)或已(yi)知基因(yin)新突變。在(zai)(zai)(zai)(zai)一些罕見的疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)，如Kabuki綜合(he)征、家族性(xing)混合(he)型低脂(zhi)血癥和脊(ji)髓(sui)小腦共濟失調癥等(deng)疾(ji)(ji)病中發(fa)現新的(de)致病基因(yin)。同時，在小細胞肺癌、慢性(xing)淋巴(ba)細胞性(xing)白血病等(deng)腫(zhong)瘤研究(jiu)和諸如肥(fei)胖癥、腦皮質發(fa)育不良等(deng)復雜疾(ji)(ji)病的(de)研究(jiu)中也取得豐碩成(cheng)果。

WES技術在篩查范圍和(he)檢出率(lv)等方面較其他(ta)測(ce)序(xu)技術具有明顯的優(you)勢。例(li)如，對于采用Sanger測序和基(ji)因(yin)芯片測序不能篩查出基(ji)因(yin)的樣本，可以采用(yong)WES來進一步基(ji)因篩(shai)查鑒定(ding)。應用WES技術能(neng)夠(gou)獲得較傳(chuan)統(tong)Sanger等方法對編碼(ma)區(qu)測序更(geng)深的覆蓋(gai)度和更(geng)準確的數據。由于信(xin)息量的大幅度增(zeng)加，WES可以獲得(de)更多個體的編(bian)碼(ma)區(qu)信息，因(yin)此成為檢測致病基因(yin)和易感(gan)基因(yin)位(wei)點的有效手(shou)段。與連鎖分析定位(wei)方(fang)法比較(jiao)，WES對家系的要求(qiu)并不(bu)十分嚴格(ge)，在單基因遺傳病同一(yi)家系中有2~3個(ge)患者和1個正(zheng)常人即(ji)可進行致病基因的(de)鑒定研究，而不(bu)(bu)需(xu)要連(lian)續三代的(de)遺(yi)傳家(jia)系(xi)。由于不(bu)(bu)需(xu)要嚴(yan)格的(de)三代以上的(de)遺(yi)傳家(jia)系(xi)，WES使以前不能進行研究的家系成(cheng)為可能。不僅對于單基因(yin)遺傳病(bing)(bing)是(shi)一個(ge)很好的研究手(shou)段，對于許多常見病(bing)(bing)，如腫瘤、糖尿病(bing)(bing)等疾(ji)病(bing)(bing)也可進行大(da)規模比較研究。

2.3全基因組重測序(WGS)

WGS是對(dui)已知基(ji)(ji)因組(zu)序列(lie)(lie)的物種進行(xing)不同(tong)個體的全基(ji)(ji)因組(zu)的測(ce)序，經過數(shu)據分析后(hou)對(dui)序列(lie)(lie)進行(xing)拼接、組(zu)裝(zhuang)并獲得基(ji)(ji)因組(zu)圖譜，或是對(dui)不同(tong)組(zu)織進行(xing)測(ce)序并分析體細胞突變的一種研究方法(fa)。盡管WES可以(yi)快速全面(mian)地找出個體基因組(zu)上的(de)所有(you)突變，從而找到個體間的(de)差異，但對(dui)(dui)于(yu)外顯子以(yi)外的(de)區域則不能有(you)效地進行基因檢測。對(dui)(dui)于(yu)此種情況，目前還要借助WGS進行(xing)全基(ji)因(yin)組檢(jian)測(ce)。但(dan)由于(yu)人類基(ji)因(yin)組過于(yu)龐大，一次單端(duan)全基(ji)因(yin)組測(ce)序很難達(da)到所需要的(de)測(ce)序深(shen)度(du)。因(yin)此，需要重(zhong)復測(ce)序或雙端(duan)測(ce)序，由此帶(dai)來測(ce)序成本(ben)的(de)大幅(fu)度(du)提高和(he)由于(yu)不能(neng)達(da)到足夠的(de)測(ce)序深(shen)度(du)所導(dao)致的(de)結果準(zhun)確性的(de)降(jiang)低。而對于(yu)臨床疾病診(zhen)斷(duan)和(he)普通科研工(gong)作，其(qi)高昂的(de)檢(jian)測(ce)費用也(ye)是(shi)難以承(cheng)受(shou)的(de)。盡管如此，對于(yu)部分臨床研究和(he)WES不能解決(jue)的(de)科研課(ke)題(ti)還需要(yao)借助(zhu)WGS進(jin)行更加全面(mian)的基因檢測。

3、展望

NGS的(de)出(chu)現為新興的(de)基因(yin)(yin)組技術增添了無限的(de)活力(li)和想(xiang)象空(kong)間。特別是(shi)基因(yin)(yin)芯(xin)片(pian)的(de)問世和已在臨床(chuang)上應用于大樣本的(de)疾病篩查和基因(yin)(yin)診(zhen)斷中所(suo)展現出(chu)的(de)活力(li)，以及其商業(ye)化發展的(de)模式都令人鼓舞。在眼科(ke)是(shi)單(dan)基因(yin)(yin)病最常見的(de)學科(ke)，利用芯(xin)片(pian)技術進行Laber病的(de)篩查(cha)已使很多病因不清(qing)楚(chu)的(de)視神經(jing)萎(wei)縮得到明確診斷。而原發(fa)性開角型青光(guang)眼(yan)是眼(yan)科最具隱蔽(bi)性和危險性的(de)致盲性眼(yan)病，其(qi)致病基因或(huo)突變的(de)鑒定(ding)研(yan)究對疾(ji)病篩查(cha)將有著(zhu)非常重要的(de)臨(lin)床價(jia)值和巨大(da)的(de)商業價(jia)值。在新生(sheng)兒糖(tang)尿病的(de)篩查(cha)中采用基因芯片(pian)技術可以更加快速、全面經(jing)濟(ji)，避(bi)免第一代測序過于繁瑣(suo)和漏(lou)檢(jian)。

基因芯片(pian)技術(shu)在產前(qian)(qian)診斷中更加具有發展(zhan)前(qian)(qian)景。只要(yao)對孕(yun)婦進行(xing)DNA血(xue)液檢(jian)(jian)(jian)查(cha)即可(ke)進行遺(yi)傳疾病的(de)(de)(de)篩(shai)查(cha)，避免以往通過羊膜(mo)穿刺(ci)抽取羊水(shui)進行有(you)創(chuang)檢(jian)(jian)(jian)查(cha)的(de)(de)(de)局限性和(he)(he)危險性。目前，基(ji)(ji)因檢(jian)(jian)(jian)測(ce)技術(shu)水(shui)平的(de)(de)(de)提升和(he)(he)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)費用(yong)的(de)(de)(de)不斷降低，發展大規模個(ge)體(ti)化基(ji)(ji)因檢(jian)(jian)(jian)測(ce)在(zai)(zai)不久的(de)(de)(de)將來成為可(ke)能。同時(shi)，藥物易感性基(ji)(ji)因和(he)(he)疾病發生的(de)(de)(de)易感基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)的(de)(de)(de)深(shen)入(ru)開(kai)展，個(ge)體(ti)化醫(yi)療(liao)將在(zai)(zai)基(ji)(ji)因檢(jian)(jian)(jian)測(ce)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)礎上得以實現。有(you)理由相信，隨著人(ren)們(men)生活水(shui)平的(de)(de)(de)不斷提高和(he)(he)健康意識不斷增強，基(ji)(ji)因檢(jian)(jian)(jian)測(ce)在(zai)(zai)未來醫(yi)學發展中應用(yong)前景(jing)將十(shi)分可(ke)觀。