【基因測(ce)序(xu)是什么(me)(me)】基因測(ce)序(xu)有什么(me)(me)用 基因測(ce)序(xu)原理技術
隨著基因測序(xu)(xu)技術的(de)(de)(de)發(fa)(fa)展和費用的(de)(de)(de)降低(di)，現(xian)在普通人(ren)也可以在可承(cheng)受(shou)的(de)(de)(de)經濟范圍內進行個體(ti)測序(xu)(xu)分(fen)析，測序(xu)(xu)技術成(cheng)為精準(zhun)醫學發(fa)(fa)展和個體(ti)化治療(liao)中一(yi)個非常(chang)重要的(de)(de)(de)工具，我們即將迎來一(yi)個全民測序(xu)(xu)的(de)(de)(de)時代(dai)。而這樣一(yi)種強大的(de)(de)(de)工具在科學家們的(de)(de)(de)手中又可以發(fa)(fa)揮出(chu)更(geng)大價(jia)值，挖掘出(chu)更(geng)有深度的(de)(de)(de)信息(xi)。基因測序(xu)(xu)技術在精準(zhun)醫學中得到了哪些應用呢？小(xiao)編從以下幾個方面結(jie)(jie)合(he)已發(fa)(fa)表文章(zhang)進行了總結(jie)(jie)。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在2016年4月8日(ri)那(nei)期(qi)Science期(qi)刊上(shang)，美國(guo)布羅德(de)研究(jiu)所Aviv Regev的(de)領導的(de)癌癥研究(jiu)團隊(dui)通過與麻(ma)省理工(gong)學院副(fu)教授、單細胞(bao)(bao)分析(xi)先(xian)鋒Alex Shalek合作(zuo)，利用單細胞(bao)(bao)RNA-seq方法(fa)每次一(yi)個(ge)細胞(bao)(bao)地研究(jiu)整個(ge)腫(zhong)瘤(liu)以便確定哪(na)些類(lei)型(xing)的(de)細胞(bao)(bao)存(cun)在于腫(zhong)瘤(liu)中。他們不僅(jin)分析(xi)了(le)惡性腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)(bao)，而且也分析(xi)了(le)腫(zhong)瘤(liu)內所有不同類(lei)型(xing)的(de)細胞(bao)(bao)。這(zhe)是首次開展這(zhe)樣(yang)的(de)研究(jiu)。如(ru)今，他們知道(dao)每種腫(zhong)瘤(liu)的(de)細胞(bao)(bao)組成，也知道(dao)每種類(lei)型(xing)的(de)細胞(bao)(bao)的(de)基因表達模式，這(zhe)樣(yang)就能夠回個(ge)頭去重新分析(xi)一(yi)些大體積腫(zhong)瘤(liu)測序數據（比(bi)如(ru)，癌癥基因組圖譜）以便從現存(cun)的(de)數據中找出細胞(bao)(bao)如(ru)何(he)相互(hu)作(zuo)用和(he)一(yi)定程度上(shang)利用細胞(bao)(bao)重建(jian)大塊腫(zhong)瘤(liu)樣(yang)品(pin)的(de)整體行為。
在(zai)一篇發表(biao)在(zai)國(guo)際學術期刊Nature Communication上的文章中(zhong)，來自美國(guo)的科學家(jia)們(men)對109名(ming)胰腺導管腺癌（PDA）病人進行了(le)全外顯子(zi)測序，發現了(le)PDA中(zhong)的基因突變多樣性，并且(qie)為發現PDA治(zhi)療(liao)靶點(dian)提供了(le)重要信息。
在(zai)該項研(yan)究(jiu)中，研(yan)究(jiu)人(ren)員為方便檢(jian)測基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)，同時移除非腫(zhong)瘤(liu)性組織的污染，他們利用顯(xian)微(wei)(wei)切(qie)割(ge)的方法(fa)將癌(ai)癥患者(zhe)的腫(zhong)瘤(liu)組織進(jin)(jin)行(xing)了(le)異種移植(zhi)并建立了(le)細胞(bao)系。隨(sui)后對109例(li)(li)進(jin)(jin)行(xing)過顯(xian)微(wei)(wei)切(qie)割(ge)的PDA病例(li)(li)進(jin)(jin)行(xing)了(le)全外顯(xian)子測序，經過顯(xian)微(wei)(wei)切(qie)割(ge)操作后，腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)得到富集并增強了(le)對基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)的檢(jian)測。研(yan)究(jiu)人(ren)員通過分析發現導致PDA發生的病因(yin)事件與腫(zhong)瘤(liu)突(tu)(tu)變(bian)譜具有明顯(xian)相(xiang)關性。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在歐(ou)洲泌尿外科協(xie)會的(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)公布的(de)(de)一(yi)項最新研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)成果中(zhong)，研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)對64份前(qian)列(lie)腺(xian)組(zu)織(zhi)樣本進行(xing)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)，對每一(yi)種樣本中(zhong)的(de)(de)2億個序列(lie)進行(xing)閱讀分析，結果研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)發現在腫(zhong)瘤和控(kong)制樣本中(zhong)有(you)(you)超過2000個基因都(dou)表(biao)(biao)現出(chu)了明顯的(de)(de)差異性(xing)，其(qi)中(zhong)有(you)(you)些相比已知的(de)(de)前(qian)列(lie)腺(xian)癌(ai)標志物而言表(biao)(biao)現出(chu)了較高的(de)(de)特異性(xing)和敏感性(xing);其(qi)中(zhong)一(yi)種名為TAPIR的(de)(de)非編碼(ma)RNAs則可(ke)以(yi)(yi)有(you)(you)效(xiao)抑制癌(ai)細胞的(de)(de)生長，盡管其(qi)可(ke)以(yi)(yi)轉化為臨床有(you)(you)用(yong)的(de)(de)治(zhi)療靶點還為時尚早。
研(yan)(yan)究者(zhe)在前列(lie)腺(xian)(xian)癌(ai)患者(zhe)的(de)尿(niao)液中(zhong)發(fa)(fa)現(xian)了這(zhe)些生物標(biao)(biao)志(zhi)物，檢(jian)測(ce)(ce)(ce)結(jie)果顯示其可以幫助(zhu)進行準確的(de)前列(lie)腺(xian)(xian)癌(ai)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)，基于(yu)相關研(yan)(yan)究結(jie)果，研(yan)(yan)究人(ren)員決定開(kai)發(fa)(fa)一(yi)(yi)種進行前列(lie)腺(xian)(xian)癌(ai)早期診斷(duan)的(de)高特異性及(ji)敏(min)感(gan)性的(de)，且基于(yu)尿(niao)液的(de)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)手段(duan);這(zhe)種檢(jian)測(ce)(ce)(ce)方法基于(yu)對(dui)多個(ge)生物標(biao)(biao)志(zhi)物的(de)組合(he)，相比單一(yi)(yi)標(biao)(biao)志(zhi)物而言(yan)將表現(xian)出較高的(de)特異性。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在(zai)一(yi)篇(pian)發表(biao)于(yu)(yu)Nature雜志上的(de)報道中，來(lai)自伯明翰大學的(de)研究(jiu)人(ren)員解釋了如何利(li)用(yong)基(ji)因組測序(xu)的(de)技術來(lai)快速實(shi)現對疾(ji)病(bing)暴發的(de)有效監測;文章中他們開發了一(yi)種手提箱式的(de)基(ji)因組測序(xu)“實(shi)驗室(shi)”，其(qi)中包(bao)含有一(yi)種新型的(de)DNA測序(xu)儀(yi)，最初該設備用(yong)于(yu)(yu)2015年4月在(zai)幾內亞對埃博拉(la)病(bing)人(ren)的(de)樣本進行檢測。
這項研(yan)究中(zhong)，研(yan)究人員利(li)用(yong)這種(zhong)便(bian)攜式的DNA測(ce)序儀(yi)在整個基因組庫中(zhong)鑒別出了新型的單(dan)核(he)苷酸多(duo)態性(xing)（SNPs），目前當(dang)測(ce)序工(gong)作局限于實(shi)驗室的時候，這種(zhong)便(bian)攜式機器的開發對于有效進行疾病暴發的監(jian)測(ce)而言非(fei)常重(zhong)要(yao)，研(yan)究者們還希望可以將這種(zhong)便(bian)攜式的機器應用(yong)于別的領域的研(yan)究中(zhong)，比如癌癥研(yan)究等(deng)。
在另外(wai)一項研究中，來自英國牛津大學和巴(ba)西Evandro Chagas研究所等(deng)機構的研究人員對巴(ba)西的寨(zhai)卡(ka)病(bing)毒(du)暴(bao)發(fa)進(jin)(jin)行(xing)首(shou)個基因組分(fen)析，從而提供關于這種病(bing)毒(du)如何和何時可能進(jin)(jin)入(ru)美洲方面的新信息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采(cai)用的(de)(de)(de)(de)是(shi)直接測序(xu)(xu)法(fa)(fa)。1977年，Frederick Sanger 等發明(ming)了雙(shuang)脫(tuo)氧鏈末端終止法(fa)(fa)，這(zhe)一(yi)技術(shu)隨后(hou)成為最為常用的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)測序(xu)(xu)技術(shu)。2001 年，Allan Maxam 和(he) Walter Gibert 發 明(ming)了 Sanger 測序(xu)(xu)法(fa)(fa)，并在(zai)此后(hou)的(de)(de)(de)(de) 10 年里(li)成為基(ji)因(yin)檢測的(de)(de)(de)(de)金標準(zhun)。其基(ji)本原(yuan)理即(ji)雙(shuang)脫(tuo)氧核(he)(he)苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏PCR 延(yan)伸(shen)所需的(de)(de)(de)(de) 3'-OH，因(yin)此每當 DNA 鏈加(jia)入分(fen)子(zi) ddNTP，延(yan)伸(shen)便終止。每一(yi)次 DNA 測序(xu)(xu)是(shi)由 4個獨立(li)的(de)(de)(de)(de)反(fan)應組成，將模板、引物(wu)和(he) 4 種含(han)有(you)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)放射性(xing)(xing)同(tong)位素標記的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)苷酸的(de)(de)(de)(de) ddNTP 分(fen)別與(yu)DNA 聚合(he)酶混合(he)形成長短不一(yi)的(de)(de)(de)(de)片(pian)段，大量起始點相(xiang)同(tong)、終止點不同(tong)的(de)(de)(de)(de) DNA 片(pian)段存在(zai)于反(fan)應體系中，具有(you)單(dan)個堿(jian)基(ji)差別的(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)可以(yi)被聚丙烯酰胺變性(xing)(xing)凝膠(jiao)電泳(yong)分(fen)離出來，得到放射性(xing)(xing)同(tong)位素自顯影條帶。依據電泳(yong)條帶讀取 DNA 雙(shuang)鏈的(de)(de)(de)(de)堿(jian)基(ji)序(xu)(xu)列(lie)。
人類基(ji)(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)測(ce)(ce)序正(zheng)是(shi)基(ji)(ji)于(yu)該(gai)技術完成的(de)(de)(de)。Sanger 測(ce)(ce)序這(zhe)種直(zhi)(zhi)接測(ce)(ce)序方法具(ju)有高度的(de)(de)(de)準確性和(he)簡(jian)單(dan)(dan)、快(kuai)捷等特點。目前，依然對(dui)于(yu)一些(xie)臨(lin)床上(shang)小樣本遺傳(chuan)疾病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)鑒(jian)定具(ju)有很(hen)高的(de)(de)(de)實用(yong)(yong)價(jia)值(zhi)。例(li)如(ru)，臨(lin)床上(shang)采用(yong)(yong) Sanger 直(zhi)(zhi)接測(ce)(ce)序 FGFR 2 基(ji)(ji)因(yin)證實單(dan)(dan)基(ji)(ji)因(yin) Apert 綜合征和(he)直(zhi)(zhi)接測(ce)(ce)序 TCOF1 基(ji)(ji)因(yin)可以(yi)檢(jian)出多(duo)達 90% 的(de)(de)(de)與 Treacher Collins 綜合征相關的(de)(de)(de)突(tu)變(bian)。值(zhi)得(de)注意的(de)(de)(de)是(shi)，Sanger 測(ce)(ce)序是(shi)針對(dui)已知(zhi)致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)突(tu)變(bian)位點設計引物(wu)，進行 PCR 直(zhi)(zhi)接擴增(zeng)(zeng)測(ce)(ce)序。單(dan)(dan)個突(tu)變(bian)點的(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)包括該(gai)位點在內的(de)(de)(de)外顯子片段即可，不(bu)必將(jiang)該(gai)點所在基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)全部外顯子都擴增(zeng)(zeng)。
因(yin)(yin)此，應明確定位要(yao)擴增的(de)(de)(de)位點(dian)所(suo)在的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)外(wai)顯(xian)子(zi)和(he)該點(dian)的(de)(de)(de)具(ju)體位置，設(she)計包(bao)括(kuo)該點(dian)在內的(de)(de)(de)上(shang)下游 150 ~ 200 bp 的(de)(de)(de)外(wai)顯(xian)子(zi)片段引(yin)物。此外(wai)，盡管(guan)有(you)NGS 的(de)(de)(de)出現，但 Sanger 測(ce)序對于有(you)致(zhi)病(bing)(bing)基(ji)因(yin)(yin)位點(dian)明確并且數量有(you)限(xian)的(de)(de)(de)單基(ji)因(yin)(yin)遺傳疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)致(zhi)病(bing)(bing)基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)檢測(ce)是非常(chang)經(jing)濟和(he)高效(xiao)的(de)(de)(de)。到目前為止(zhi)，Sanger 測(ce)序仍然是作(zuo)為基(ji)因(yin)(yin)檢測(ce)的(de)(de)(de)金標準，也是 NGS 基(ji)因(yin)(yin)檢測(ce)后進(jin)行家(jia)系內和(he)正(zheng)常(chang)對照組驗證的(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)手段。
值得注意的(de)是，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)目的(de)是尋找與(yu)疾病有(you)(you)關(guan)的(de)特定的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)突變。對(dui)(dui)于(yu)沒(mei)有(you)(you)明(ming)確候(hou)選基(ji)(ji)因(yin)(yin)或(huo)候(hou)選基(ji)(ji)因(yin)(yin)數量(liang)較多的(de)大樣本病例篩查是難(nan)以完(wan)成的(de)，此(ci)類測(ce)(ce)序(xu)研究還要依靠具有(you)(you)高(gao)通量(liang)測(ce)(ce)序(xu)能力(li)的(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)(ce)序(xu)具有(you)(you)高(gao)度的(de)分析準(zhun)確性(xing)，但其準(zhun)確性(xing)還取決于(yu)測(ce)(ce)序(xu)儀器以及測(ce)(ce)序(xu)條件的(de)設定。另(ling)外，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)不(bu)能檢測(ce)(ce)出大片段缺失或(huo)拷(kao)貝(bei)數變異等(deng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)突變的(de)類型，因(yin)(yin)此(ci)對(dui)(dui)于(yu)一些與(yu)此(ci)相關(guan)的(de)遺傳性(xing)疾病還不(bu)能做出基(ji)(ji)因(yin)(yin)學診斷。
1.2 連鎖分析
采用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)接測(ce)序(xu)法(fa)。在 NGS 出(chu)現(xian)(xian)之(zhi)前(qian)，國際通用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疾病(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)(ding)位克隆(long)策略是(shi)(shi)(shi)(shi)建立在大規模(mo)全(quan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)掃描和連(lian)(lian)鎖(suo)分(fen)析基(ji)(ji)礎(chu)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位置候選(xuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)克隆(long)。人類的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)染色(se)(se)體成對(dui)出(chu)現(xian)(xian)，一條來自(zi)(zi)父(fu)親，一條來自(zi)(zi)母(mu)親，每(mei)一對(dui)染色(se)(se)體在同樣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位置上(shang)擁有相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，但(dan)是(shi)(shi)(shi)(shi)其序(xu)列(lie)(lie)并不(bu)完全(quan)相(xiang)同，被稱(cheng)為(wei)父(fu)系和母(mu)系等(deng)(deng)位基(ji)(ji)因(yin)(yin)。遺(yi)傳(chuan)(chuan)標記(ji)是(shi)(shi)(shi)(shi)指在人群中表現(xian)(xian)出(chu)多態現(xian)(xian)象的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)列(lie)(lie)，可(ke)追(zhui)蹤染色(se)(se)體、染色(se)(se)體某(mou)(mou)(mou)(mou)一節段或某(mou)(mou)(mou)(mou)個基(ji)(ji)因(yin)(yin)座在家系中傳(chuan)(chuan)遞(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何一種遺(yi)傳(chuan)(chuan)特性(xing)(xing)(xing)。它(ta)存(cun)在于每(mei)一個人，但(dan)大小和序(xu)列(lie)(lie)有差別，具有可(ke)遺(yi)傳(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)和可(ke)識別性(xing)(xing)(xing)。目前(qian)采用(yong)第二(er)代遺(yi)傳(chuan)(chuan)標記(ji)，即重復序(xu)列(lie)(lie)多態性(xing)(xing)(xing)，特別是(shi)(shi)(shi)(shi)短串聯重復序(xu)列(lie)(lie)，又(you)稱(cheng)微(wei)衛星標記(ji)。連(lian)(lian)鎖(suo)分(fen)析是(shi)(shi)(shi)(shi)以連(lian)(lian)鎖(suo)這(zhe)種遺(yi)傳(chuan)(chuan)現(xian)(xian)象為(wei)基(ji)(ji)礎(chu)，研(yan)究(jiu)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與遺(yi)傳(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)標記(ji)之(zhi)間(jian)關(guan)系的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。如果控制某(mou)(mou)(mou)(mou)一表型性(xing)(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)附(fu)近存(cun)在遺(yi)傳(chuan)(chuan)標記(ji)，那么利用(yong)某(mou)(mou)(mou)(mou)個遺(yi)傳(chuan)(chuan)標記(ji)與某(mou)(mou)(mou)(mou)個擬定(ding)(ding)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)之(zhi)間(jian)是(shi)(shi)(shi)(shi)否存(cun)在連(lian)(lian)鎖(suo)關(guan)系，以及連(lian)(lian)鎖(suo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)緊密程(cheng)度就能將該基(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)(ding)位到染色(se)(se)體某(mou)(mou)(mou)(mou)一位置上(shang)。1986 年 Morton 等(deng)(deng)提出(chu)優勢對(dui)數記(ji)分(fen)法(fa)（og odds score method，LOD），主要檢測(ce)兩(liang)基(ji)(ji)因(yin)(yin)以某(mou)(mou)(mou)(mou)一重組率連(lian)(lian)鎖(suo)時的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)似然性(xing)(xing)(xing)。LOD 值(zhi)為(wei)正，支持連(lian)(lian)鎖(suo)；LOD 值(zhi)為(wei)負，則否定(ding)(ding)連(lian)(lian)鎖(suo)。通過計(ji)算(suan)家系中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)衛星標記(ji)與致(zhi)病(bing)位點(dian)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) LOD 值(zhi)，可(ke)以初步估算(suan)二(er)者間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳(chuan)(chuan)距(ju)離及連(lian)(lian)鎖(suo)程(cheng)度，從(cong)而(er)確定(ding)(ding)該基(ji)(ji)因(yin)(yin)在染色(se)(se)體上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)粗略位置。然后(hou)利用(yong)該區(qu)域(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)染色(se)(se)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)圖譜，分(fen)析定(ding)(ding)位區(qu)域(yu)內(nei)所有基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能與表達，選(xuan)擇合適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)候選(xuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)進行突變(bian)檢測(ce)，最終(zhong)將致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)(ding)位或克隆(long)。
然而(er)，采用(yong)連鎖(suo)分析(xi)(xi)進行基因檢測存在(zai)(zai)很大的(de)局限性(xing)。不但所需遺(yi)傳(chuan)樣本量較大，一般要(yao)求提供三代及以上遺(yi)傳(chuan)家系患者血樣，而(er)且(qie)數據(ju)量大、處理復雜、產出速度(du)較慢(man)、定位(wei)(wei)不夠精確(que)（一般只(zhi)能(neng)定位(wei)(wei)在(zai)(zai)染色體某(mou)一區間），這就使(shi)(shi)得研究(jiu)工作繁重(zhong)和定位(wei)(wei)基因的(de)時間周(zhou)期特(te)別長(chang)。目前，連鎖(suo)分析(xi)(xi)采用(yong)的(de)單核(he)苷酸(suan)多肽(tai)性(xing)和短串(chuan)聯重(zhong)復序列(lie)還在(zai)(zai)使(shi)(shi)用(yong)，但經典的(de)間接測序方法，如單鏈構象多肽(tai)性(xing)、變性(xing)梯度(du)凝膠電(dian)泳和異源(yuan)雙鏈分析(xi)(xi)在(zai)(zai)美國已(yi)被(bei)淘汰，而(er)在(zai)(zai)發展(zhan)中國家作為研究(jiu)手段還在(zai)(zai)有限使(shi)(shi)用(yong)。
2、新一代測序（NGS）
主 要 包(bao) 括 全 基 因(yin) 組 重 測(ce)(ce)(ce) 序(xu)(xu)（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯子組測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)（whole-exomesequencing，WES）和目標區域測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)（Targeted regionssequencing，TRS），它們同(tong)屬于(yu)新一(yi)代測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)技術(shu)。總體而言，NGS 技術(shu)具有通量(liang)大(da)、時(shi)間短(duan)(duan)、精(jing)確(que)度高(gao)和信息量(liang)豐富(fu)等優點，使得遺傳學者可以(yi)在短(duan)(duan)時(shi)間內對(dui)感興趣(qu)的(de)基因(yin)進行精(jing)確(que)定(ding)位。但這些不同(tong)的(de)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)技術(shu)在測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)范圍(wei)、數(shu)據分析(xi)量(liang)以(yi)及測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)費用(yong)和時(shi)間等方面(mian)又有很大(da)差別，如果選擇適合的(de)方法，對(dui)于(yu)臨(lin)床診(zhen)斷和科學研究將(jiang)起到事半(ban)功倍的(de)作用(yong)。
2.1 目標區域測序
目(mu)前常用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)基(ji)因(yin)芯(xin)(xin)片(pian)(pian)技術(shu)。其(qi)測(ce)序(xu)原理(li)是(shi)基(ji)于 DNA 雜(za)(za)交(jiao)原理(li)，利(li)(li)用目(mu)標基(ji)因(yin)組(zu)(zu)(zu)區(qu)(qu)域(yu)定(ding)(ding)(ding)制的(de)(de)(de)(de)(de)(de)探針(zhen)與(yu)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)(zu) DNA 進(jin)行芯(xin)(xin)片(pian)(pian)雜(za)(za)交(jiao)或溶液雜(za)(za)交(jiao)，將目(mu)標基(ji)因(yin)區(qu)(qu)域(yu) DNA 富集(ji)，再通(tong)過NGS 技術(shu)進(jin)行測(ce)序(xu)。其(qi)測(ce)序(xu)過程是(shi)通(tong)過把數(shu)以萬計的(de)(de)(de)(de)(de)(de) cDNA 或寡聚核(he)苷(gan)酸(suan)置(zhi)于芯(xin)(xin)片(pian)(pian)上(shang)制成(cheng)(cheng)列陣，將芯(xin)(xin)片(pian)(pian)上(shang)固定(ding)(ding)(ding)好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)已(yi)知(zhi)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核(he)苷(gan)酸(suan)探針(zhen)與(yu)溶液中(zhong)含有熒光標記的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相應(ying)核(he)酸(suan)序(xu)列進(jin)行互補配對(dui)，根據(ju)測(ce)序(xu)儀所顯示強(qiang)熒光的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)置(zhi)和強(qiang)度(du)，獲取每組(zu)(zu)(zu)點(dian)陣列信息(xi)(xi)，再利(li)(li)用生物(wu)信息(xi)(xi)學算法確(que)定(ding)(ding)(ding)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶核(he)苷(gan)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列組(zu)(zu)(zu)成(cheng)(cheng)。測(ce)序(xu)所選定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)標區(qu)(qu)域(yu)可以是(shi)連續的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)列，也可以是(shi)分布(bu)在同一(yi)(yi)個(ge)(ge)染色體不同區(qu)(qu)域(yu)或不同染色體上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)(duan)。目(mu)標區(qu)(qu)域(yu)測(ce)序(xu)技術(shu)，對(dui)于以往通(tong)過連鎖分析將基(ji)因(yin)突變鎖定(ding)(ding)(ding)在染色體某(mou)一(yi)(yi)片(pian)(pian)段(duan)(duan)區(qu)(qu)域(yu)內，但無法找出突變是(shi)一(yi)(yi)個(ge)(ge)非常好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)進(jin)一(yi)(yi)步檢測(ce)手段(duan)(duan)。2010 年，Nicholas等使(shi)用基(ji)因(yin)分型芯(xin)(xin)片(pian)(pian)聯(lian)合連鎖分析技術(shu)，成(cheng)(cheng)功發現頭小(xiao)畸(ji)形的(de)(de)(de)(de)(de)(de)新基(ji)因(yin) WDR62，文章發表在《NatGenet》雜(za)(za)志。類似的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究在家族性胰腺癌中(zhong)確(que)定(ding)(ding)(ding) 8 個(ge)(ge)候選變異(yi)位(wei)點(dian)和在家族性滲(shen)出性玻璃體視網膜病(bing)變發現易感基(ji)因(yin) TSPAN12。
基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)(xin)(xin)片測(ce)(ce)(ce)序(xu)技術可以(yi)(yi)將經過連鎖(suo)(suo)分(fen)析鎖(suo)(suo)定了目(mu)標(biao)(biao)范(fan)(fan)圍或經過全基(ji)(ji)因(yin)(yin)組篩選的(de)(de)特(te)定基(ji)(ji)因(yin)(yin)或區(qu)域(yu)進行更深一層(ceng)的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)，是(shi)解(jie)決連鎖(suo)(suo)分(fen)析無法(fa)發現(xian)致病基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)有效手(shou)段。基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)(xin)(xin)片技術對于(yu)已知(zhi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)突變的(de)(de)篩查具有明顯優勢(shi)，可以(yi)(yi)快速、全面地檢測(ce)(ce)(ce)出目(mu)標(biao)(biao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)突變。同時(shi)，由于(yu)目(mu)標(biao)(biao)區(qu)域(yu)受到(dao)了限制(zhi)，測(ce)(ce)(ce)序(xu)范(fan)(fan)圍大幅度減少，測(ce)(ce)(ce)序(xu)時(shi)間和費用相應(ying)降低(di)。但(dan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)(xin)(xin)片檢測(ce)(ce)(ce)所需要的(de)(de) DNA 的(de)(de)量(liang)要大，由于(yu)已提取(qu)的(de)(de) DNA 存在降解(jie)的(de)(de)風險，用于(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)(xin)(xin)片研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)血標(biao)(biao)本最好(hao)是(shi)冰凍的(de)(de)全血，這樣可以(yi)(yi)使用于(yu)檢測(ce)(ce)(ce) DNA 的(de)(de)量(liang)有充分(fen)保證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外顯(xian)子組是(shi)(shi)單個個體的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組 DNA 上所有(you)蛋(dan)白(bai)質編碼序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)總合。人類外顯(xian)子組序(xu)(xu)(xu)列(lie)約(yue)占人類全(quan)(quan)部(bu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de) 1%，但大約(yue)包(bao)含 85% 的(de)致(zhi)病突變。WES 是(shi)(shi)利用(yong)序(xu)(xu)(xu)列(lie)捕(bu)獲技(ji)(ji)術將(jiang)全(quan)(quan)外顯(xian)子區(qu)(qu)域(yu) DNA 捕(bu)捉(zhuo)并富集(ji)(ji)后進行高通量測序(xu)(xu)(xu)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)分(fen)析方法(fa)。采用(yong)的(de)技(ji)(ji)術平臺(tai)主要(yao)是(shi)(shi)羅氏公(gong)司的(de) SeqCap EZ 全(quan)(quan)外顯(xian)子捕(bu)獲系統，Illumina 公(gong)司的(de) Solexa 技(ji)(ji)術和 Agilent 公(gong)司的(de) SureSelect 外顯(xian)子靶向序(xu)(xu)(xu)列(lie)富集(ji)(ji)系統。其(qi)捕(bu)獲的(de)目標區(qu)(qu)在 34 ~ 62 M 之間(jian)，不(bu)僅(jin)包(bao)括編碼區(qu)(qu)同(tong)時也加(jia)入了部(bu)分(fen)非編碼區(qu)(qu)。NGS 的(de)測序(xu)(xu)(xu)過程主要(yao)包(bao)括DNA 測序(xu)(xu)(xu)文庫的(de)制備、錨(mao)定橋接、PCR 擴增、單堿(jian)基(ji)(ji)(ji)延(yan)伸測序(xu)(xu)(xu)和數(shu)據分(fen)析。研究者根據測序(xu)(xu)(xu)儀捕(bu)獲到在測序(xu)(xu)(xu)過程中摻入有(you)不(bu)同(tong)熒光標記堿(jian)基(ji)(ji)(ji)片段，經(jing)計算機(ji)將(jiang)熒光信號轉(zhuan)化成不(bu)同(tong)顏色的(de)測序(xu)(xu)(xu)峰圖和堿(jian)基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)列(lie)。基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)測序(xu)(xu)(xu)結果與NCBI的(de)SNP數(shu)據庫、千人基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組數(shu)據庫等(deng)國際權威數(shu)據庫比(bi)對，最終確定是(shi)(shi)否為(wei)突變基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)。
自NGS 技術問世以來，利用 WES 在臨床疾(ji)(ji)病(bing)致(zhi)病(bing)基(ji)因(yin)(yin)的(de)鑒定研究中取得前所未(wei)有的(de)成果(guo)。這些成果(guo)不僅集(ji)中在單基(ji)因(yin)(yin)遺傳(chuan)疾(ji)(ji)病(bing)，還在多(duo)基(ji)因(yin)(yin)影響(xiang)的(de)復雜疾(ji)(ji)病(bing)中獲得大量(liang)相關基(ji)因(yin)(yin)的(de)發現(xian)(xian)。在單基(ji)因(yin)(yin)遺傳(chuan)性(xing)疾(ji)(ji)病(bing)中，如(ru)視網(wang)膜色素(su)變(bian)性(xing)、終端骨發育不良(liang)等(deng)發現(xian)(xian)新(xin)基(ji)因(yin)(yin)或已知基(ji)因(yin)(yin)新(xin)突變(bian)。在一些罕見的(de)疾(ji)(ji)病(bing)中，如(ru) Kabuki 綜合(he)(he)征、家族(zu)性(xing)混合(he)(he)型低(di)脂(zhi)血癥和(he)脊髓小腦共濟失調(diao)癥等(deng)疾(ji)(ji)病(bing)中發現(xian)(xian)新(xin)的(de)致(zhi)病(bing)基(ji)因(yin)(yin)。同時，在小細胞肺癌、慢性(xing)淋巴細胞性(xing)白血病(bing)等(deng)腫(zhong)瘤研究和(he)諸如(ru)肥胖(pang)癥、腦皮(pi)質發育不良(liang)等(deng)復雜疾(ji)(ji)病(bing)的(de)研究中也取得豐碩成果(guo)。
WES 技(ji)術(shu)在(zai)篩(shai)(shai)查(cha)范圍(wei)和檢出(chu)率等(deng)(deng)方(fang)(fang)面較(jiao)其他測(ce)序技(ji)術(shu)具有(you)明顯(xian)的(de)(de)(de)優(you)勢(shi)。例如，對(dui)(dui)于(yu)采用(yong) Sanger測(ce)序和基(ji)(ji)因(yin)芯片測(ce)序不能(neng)篩(shai)(shai)查(cha)出(chu)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)樣本，可(ke)以(yi)(yi)采用(yong) WES 來(lai)進(jin)(jin)(jin)一步基(ji)(ji)因(yin)篩(shai)(shai)查(cha)鑒(jian)定。應(ying)用(yong) WES技(ji)術(shu)能(neng)夠獲得較(jiao)傳(chuan)統 Sanger 等(deng)(deng)方(fang)(fang)法(fa)對(dui)(dui)編(bian)碼區測(ce)序更深的(de)(de)(de)覆蓋度和更準確的(de)(de)(de)數據。由于(yu)信(xin)息(xi)量的(de)(de)(de)大幅度增加，WES 可(ke)以(yi)(yi)獲得更多(duo)個(ge)體(ti)的(de)(de)(de)編(bian)碼區信(xin)息(xi)，因(yin)此成為檢測(ce)致病(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)和易(yi)感基(ji)(ji)因(yin)位點(dian)的(de)(de)(de)有(you)效手段。與連(lian)鎖分析定位方(fang)(fang)法(fa)比較(jiao)，WES 對(dui)(dui)家(jia)(jia)系(xi)(xi)的(de)(de)(de)要求(qiu)并(bing)不十(shi)分嚴格，在(zai)單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病(bing)(bing)同(tong)一家(jia)(jia)系(xi)(xi)中有(you) 2 ~3 個(ge)患者和 1 個(ge)正常人即(ji)可(ke)進(jin)(jin)(jin)行致病(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)鑒(jian)定研(yan)究(jiu)(jiu)，而不需要連(lian)續三(san)(san)代(dai)的(de)(de)(de)遺傳(chuan)家(jia)(jia)系(xi)(xi)。由于(yu)不需要嚴格的(de)(de)(de)三(san)(san)代(dai)以(yi)(yi)上的(de)(de)(de)遺傳(chuan)家(jia)(jia)系(xi)(xi)，WES 使以(yi)(yi)前不能(neng)進(jin)(jin)(jin)行研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)家(jia)(jia)系(xi)(xi)成為可(ke)能(neng)。不僅對(dui)(dui)于(yu)單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病(bing)(bing)是(shi)一個(ge)很(hen)好(hao)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)手段，對(dui)(dui)于(yu)許多(duo)常見病(bing)(bing)，如腫(zhong)瘤、糖尿病(bing)(bing)等(deng)(deng)疾病(bing)(bing)也可(ke)進(jin)(jin)(jin)行大規模比較(jiao)研(yan)究(jiu)(jiu)。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
